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撰稿专家 | 刘杨副教授(浙江大学)
点评专家 | 张博士(自噬领域)
蔡教授(外泌体领域)
文献概述
一、研究背景介绍
我们都知道病原体之所以致病通常是因为进化出了应对宿主防御系统的“逃逸”机制。而机体在面对病原微生物入侵,也会产生“清除”和“逃逸”两种防御机制。大部分研究聚焦于机体的“清除”机制,而“逃逸”机制鲜有报道。
详见上一期文章
【Nature/Cell host& microbe】连续性研究——病原体应对宿主防御系统的“逃逸机制”
二、文章亮点
首次报道细胞通过分泌表达细菌毒素受体的外泌体(Exosome)作为“诱弹”吸附中和细菌毒素,逃脱细菌毒素攻击,并减少造成的损伤;
通过阻断自噬溶酶体形成的不同阶段对ADAM10的表达和分布及外泌体产生,发挥不同的影响。
专家点评
可借鉴之处和主要发现:
难能可贵的是本文的立项线索并不突出,因为看起来该团队2015年的Cell子刊已经把工作基本做完了,ATG16L1 KD 增加了α-toxin对内皮细胞的毒性,基于ADAM10是金葡菌α-toxin的受体,检测发现ATG16L1 KD导致内皮细胞的ADAM10蛋白水平升高,合乎逻辑也顺理成章。除了“ATG16L1 KD是如何导致内皮细胞的ADAM10蛋白水平升高”的这一问题,而蛋白水平升高但mRNA没有差异,相比对照组,敲减细胞的exosome上该蛋白并无富集(exosome膜和细胞膜上同高同低,也就不会有诱弹的作用),总蛋白又和膜表达同时增加(基本排除了浆-膜转运机制和膜外蛋白酶切割消耗的影响),剩下最可能的就是microRNA等对其蛋白翻译的调节、泛素化降解等食之无味的机制,大部分团队就会到此为止了。
但是该团队“小题大做”做出了这篇Nature主刊的论文。他们坚持对自噬形成的各个阶段阻断检测对外泌体分泌和ADAM10富集的影响,结果发现阻断溶酶体酸化,抑制自噬溶酶体形成,可降低细胞膜ADAM10表达,同时增加exosome的分泌,更重要的是增加ADAM10在exosome上的表达,进一步发现细菌DNA可通过TLR9促进exosome分泌并抑制溶酶体酸化。在细菌静脉注射的菌血症模型里,主要是诱导肝细胞增加分泌exosome,而注射exosome显著减少了菌血症造成的致死。
图片解析
因为本文主要工作是对自噬的各阶段的阻断检测对外泌体分泌和ADAM10富集的影响,译者简单地DIY了一张阻断的示意图,并简述自噬的进程,以帮助对自噬不太熟悉的读者更好的理解本文。
自噬是一个多步骤的动态过程, 包括诱导、 成核、 延伸、 自噬体形成、 自噬体可以和晚期内体/多囊泡体融合形成自噬内涵体(可产生secretory autophagy,运输无分泌信号肽的蛋白到胞外,和影响外泌体分泌),并和溶酶体融合形成自噬溶酶体形成(经典的自噬),下图的红色X代表作者分别阻断的位置:
Fig 1
问题:ATG16L1对ADAM10表达的抑制是否是溶酶体和/或蛋白酶体依赖的?
实验验证:
ATG16L1 KD A549细胞的ADAM10的膜表达(Fig1a,b)和总蛋白(Fig1c,d)都显著升高,且和敲除ATG16L1的上游激酶ULK1或结合蛋白ATG5效应一致(Fig1f);ATG16L1 KD A549细胞抵抗α-toxin介导的细胞损伤(Fig1e);而溶酶体酸化抑制剂 (NH4Cl, chloroquine or bafilomycin)造成膜ADAM10表达下调(Fig1g,h);蛋白酶抑制剂MG132也不影响ADAM10的表达水平(FigS1h,i)。
(Fig 1)
(FigS1h,i)
结论:ATG16L1对ADAM10表达的抑制与溶酶体和蛋白酶体无关。
Fig2
问题: ATG16L1 KD抑制自噬体形成是否会进一步影响ADAM10在外泌体上的表达?
实验验证:
ATG16L1 KD造成外泌体的ADAM10蛋白减少(Fig2a,b),但这是因为外泌体分泌减少所致(Fig2c-f),而不影响单个外泌体上的ADAM10表达量(Fig2g);KD小鼠血清中的外泌体也显著下降(Fig2h)。
结论:抑制自噬体形成可减少外泌体的分泌,但不影响外泌体上的ADAM10表达水平。
专家推理:这可能是通过影响了多囊泡体的释放。
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问题:阻断自噬体和溶酶体的融合是否影响ADAM10在细胞膜上的表达?
实验验证:
敲除自噬体和溶酶体的融合的关键蛋白STX17(不影响自噬内涵体和溶酶体的融合)导致ADAM10总蛋白水平增加,但不影响细胞膜上的ADAM10表达水平(Fig2j,k),而外泌体的分泌量显著增加(Fig2i)。
结论:阻断自噬溶酶体的形成增加ADAM10总蛋白水平。
专家推理: 这可能和减少的自噬降解相关,但不影响细胞膜上的ADAM10表达。而增加的外泌体的产生,可能是因为阻断了经典自噬溶酶体的形成,导致自噬进程向分泌自噬这条非经典途径转向,间接促进了多囊泡体和自噬内涵体的胞外释放。
Fig3
问题:细菌成分是否会影响自噬相关外泌体产生?
实验验证:
细胞感染实验发现四种细菌(金葡菌、肺炎链球菌、柠檬酸杆菌和伤寒沙门氏菌)都显著的促进外泌体的分泌(Fig3a);而这个效应是细菌DNA作用于TLR9介导的(Fig3b,c),同时TLR9信号可影响溶酶体酸化(FigS5a-c);而通过mTOR抑制剂Torin-1活化自噬不能诱导外泌体分泌的额增加(FigS4k,l)。但GE4869干扰多囊泡体出芽产生外泌体可显著减少TLR9信号诱导的外泌体释放(FigS4m);静脉注射构建的菌血症小鼠模型发现血清中外泌体主要来自于肝脏细胞,而不是巨噬和树突状细胞(Fig3d-h)。
(Fig3)
(FigS5a-c)
(FigS4k,l,m)
结论:细菌DNA刺激的TLR9信号介导的外泌体分泌不依赖于自噬的发生,细菌DNA可以通过内体上表达的TLR9促进肝脏细胞分泌外泌体。
Fig2i
问题:TLR9信号抑制的溶酶体酸化是否是其诱导外泌体高表达的机制?
实验验证:溶酶体抑制剂chloroquine or bafilomycin处理不仅增加了外泌体的释放,而且导致外泌体高表达ADAM10蛋白(Fig2i和FigS3a-d)。
(Fig2i)
(FigS3a-d)
结论:细菌DNA刺激的TLR9信号,通过影响溶酶体酸化促进外泌体的释放,而且导致外泌体高表达ADAM10蛋白。
专家推理:其可能的原因是阻断自噬溶酶体的形成增加ADAM10总蛋白水平,同时导致自噬进程向分泌自噬这条非经典途径转向,间接促进了多囊泡体和自噬内涵体的胞外释放。溶酶体抑制剂促进,而STX17 KD不影响外泌体上的ADAM10表达的区别可能在于STX17不影响自噬内涵体和溶酶体的融合,而溶酶体抑制剂抑制自噬内涵体和溶酶体的融合,这不仅促进了自噬进程向分泌自噬这条非经典途径转向,间接促进了多囊泡体和自噬内涵体的胞外释放,同时减少了自噬内涵体里ADAM10的降解。
Fig4
问题:ADAM10阳性的外泌体是否可为机体提供保护?
ADAM10阳性的外泌体保护细胞免受金葡菌α-toxin的损伤(Fig4a,b);因为其可以吸附α-toxin,并使其从寡聚化解离成单体状态(Fig4c),同时提高菌血症小鼠存活率(Fig4g-j)。巨噬细胞和A549细胞来源的外泌体也可分别中和LukED和diphtheria毒素(Fig4d-f)。
结论:
特邀专家点评
专家1:张建宾博士
浙江省人民医院副研究员,浙江省杰青、钱江人才。毕业于新加坡国立大学Yong Loo Lin医学院,获博士学位。从事自噬领域研究十余年,在国际知名期刊Autophagy、Nat Protocol、ACS Cen Sci、Cell Res、Med Res Rev等发表多篇自噬领域相关论文。
细胞自噬发生过程分为早期阶段(自噬泡形成)、晚期阶段(自噬泡与溶酶体融合、溶酶体降解自噬泡内容物)。作者首先探讨自噬早期阶段对外泌体分泌和ADAM10富集的影响,结果发现干扰自噬相关基因ATG5、ATG16L1、ATG7、ULK1等表达后,exosome形成数量减少,降解ADAM10能力降低,引起细胞膜ADAM10表达显著升高。但是在自噬晚期阶段,观察到相反现象,无论使用si-STX17抑制自噬泡与溶酶体融合,还是使用溶酶体抑制剂,都促进大量exsome形成,降解ADAM10能力增加,引起细胞膜ADAM10表达显著减少。但是,我们也发现一些不足之处,使用RNA干扰手段或化学药物调控细胞自噬水平,两者作用机制不同,实验结果也会有所差异。在STX17干扰后的细胞内,我们发现细胞膜ADAM10表达水平升高(见j图),意味着以自噬溶酶体方式降解ADAM10的能力下降,尽管作者结果显示exsome的形成数量显著增加。此外,自噬抑制剂CQ或BAF处理细胞时间较长,细胞活力可能受到影响,这也间接影响细胞内exsome形成。在功能方面,干扰ATG16L1导致α-toxin引起更多细胞死亡,从ATG16L1低表达的细胞中分离的exsome抗毒素能力显著降低,提示自噬通过促使表达细菌毒素受体的exsome分泌而保护细胞存活。有趣的是本文作者发现肝细胞来源的exosome,而不是巨噬和树突状细胞的,对金葡菌α-toxin发挥抵抗作用,但搜索BioGPS等数据库显示巨噬细胞和DC也表达ADAM10,甚至高于肝细胞,所以这背后的机制值得继续探索。
专家2:蔡教授
蔡教授,专注外泌体理论和应用研究。15年来,发表了包括Immunity在内的数十篇外泌体领域的高水平论文,并有多项相关专利正在临床转化。
外泌体是以内体依赖的方式产生的具有脂质双分子层结构的纳米级囊泡。胞膜内陷形成早期内体,早期内体在成熟过程中,相互融合,形成晚期内体,晚期内体通过脂质双分子层的内出芽,形成腔内囊泡,从而进一步发育成熟为多囊泡体。多囊泡体有两种去向,一种去向是与溶酶体融合,介导内容物的降解;另一种则是与质膜融合,将腔内囊泡释放到胞外,形成外泌体。本文从ATG16L1蛋白为切入点,揭示细菌通过自噬体途径调节外泌体的形成。正常情况下,细菌感染,通过DNA和CpG DNA激活感染细胞的TLR9信号,促进含有ADAM10蛋白的自噬体与多囊泡体融合,随后多囊泡体/自噬体的联合体与质膜融合,促进外泌体的生成,从而介导ADAM10蛋白以外泌体依赖的途径外排。当抑制ATG16L1的水平时,这一途径受阻,所产生的结果便不难理解。既ADAM10总蛋白和膜蛋白在细胞积累。而ADAM10是α-toxin的受体,结果细胞对α-toxin抵抗能力减弱。自噬途径参与外泌体的调节已经有不少文献报道。TLR信号参与外泌体生成调节在该文中也并非首次报道。作者从另外一个独特的视角解读了自己的发现。他们认为在细菌感染时,宿主细胞通过增加含有ADAM10蛋白外泌体的释放,利用该外泌体为诱饵,去中和细菌产生的α-toxin,从而使宿主细胞增强对细菌的抗性。这一视角很大程度上提高了本文的科学意义,因为它揭示了宿主细胞主动逃逸细菌感染的防御机制,从而为临床上治疗抗生素抵抗细菌感染患者,尤其是耐甲氧金葡菌感染的患者提供了崭新的治疗思路。