期刊：Nature Communications
影响因子：12.124
作者单位：复旦大学上海医学院
发表时间：2016年4月6日
01
摘要
环状RNAs（circRNAs）代表一类广泛而多样的内源性RNAs，可调控真核生物中的基因表达。然而，人类circRNAs的调节和功能仍然大部分未知。本研究从六个正常组织和七种癌症的去核糖体RNA测序中检测到至少27000个候选的circRNAs。许多这些circRNAs在正常和癌组织之间差异表达。作者进一步表征了来自HIPK3基因的外显子2的一个丰富的circRNA，称为circHIPK3。circHIPK3沉默（而不是HIPK3 mRNA）显著抑制人类细胞生长。通过荧光素酶筛选试验，观察到circHIPK3具有18个潜在结合位点作为9个miRNAs海绵。具体而言，研究显示circHIPK3直接结合miR-124并抑制miR-124活性。研究结果提供证据表明从前体mRNA产生的环状RNA可能在人类细胞中具有调节作用。
研究背景
来自反向剪接外显子的环状RNAs（circRNAs）最近被鉴定为天然存在的非编码RNA家族，其在真核转录组中高度存在。已经在各种细胞系和不同物种中成功鉴定了大量的circRNAs。最近，已经证明circRNA作为microRNA（miRNA）海绵来调节基因表达。具体而言，含有70多个常规miR-7结合位点的circRNA ciRS-7（也称为CDR1as）已经被鉴定为miRNA抑制剂。然而，只有少数这样的circRNA包含多个结合位点来捕获一个特定的miRNA，并且circRNA的功能仍然大部分是未知的。
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研究路线
1、 circHIPK3筛选及鉴定：circRNA高通量测序、生物信息分析、qRT-PCR、Northern blot 、RNA FISH等
2、 circHIPK3生物合成机制鉴定：表达载体(含有不同侧翼的Alu序列的截短体)、CRISPR/Cas9
3、 circHIPK3功能研究：qRT–PCR、RNAi、CCK-8检测、EdU等
4、 机制研究：RIP、荧光素酶报告基因、miRNA mimics、ClIP、qRT–PCR、RNA荧光原位杂交
04
研究结果
circHIPK3筛选及验证
图1
作者通过去核糖体RNA高通量测序共鉴定出27296个环状RNA分子，circRNA在不同组织中的表达模式非常特异（图1a）。生物信息分析显示单个蛋白基因可以产生多个circRNAs，但同一基因起源的circRNA也存在优势表达的circRNA。CircHIPK3由HIPK3基因的2号外显子形成，相比于HIPK3基因产生的其他circRNAs分子表达丰度最高，qPCR检测和测序结果证实circHIPK3的存在（图1b）。FISH显示circHIPK3主要存在细胞质（图1c）。
circHIPK3功能研究
图2
作者通过将2号外显子和侧翼Alu序列分段构建表达载体以及采用CRISPR/Cas9技术，发现circHIPK3成环表达需要两翼Alu序列协助，不可或缺（图2a,2b）。使用siRNA敲降circHIPK3后发现显著抑制肿瘤细胞的增殖能力，EdU实验得到同样的结论（图2c,2d）。而敲降线性HIPK3则无作用。
机制研究
图3
作者借助公共数据分析发现在circHIPK3基因组位置存在许多AGO2结合位点，暗示miRNA可能结合circHIPK3，进一步预测发现circHIPK3序列存在多种miRNA结合位点。通过miRNA靶基因荧光素酶报告基因筛选系统，鉴定9个miRNA对荧光素酶活性有显著抑制效果（图3a）。其中miR-124的抑制效果最为明显（图3b）。共定位实验表明，circHIPK3与miR-124相互结合（图3c）。异位表达的circHIPK3能缓解miR-124抑制增殖的作用。在人的6个正常组织中检测circHIPK3和miR-124的表达，发现在脑中表达最高，表达谱模式正相关，进一步表明circHIPK3和miR-124结合来调控细胞生长（图3d）。
05
结论
图4
1、 鉴定出人类六种正常组织和七种肿瘤组织中近三万种环状RNA及特征；
2、 鉴定高表达的外显子样环状RNA circHIPK3；
3、 含有多个重复序列的长内含子对circHIPK3生物合成具有重要作用 ；
4、 环状RNA circHIPK3与包括miR-124的9种miRNA结合起调控作用。
本研究中所用siRNA、EdU、miRNA mimics均由锐博生物提供。
原文：Zheng Q, Bao C, Guo W, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs[J]. Nature communications, 2016, 7.