二战爆发前夕，日军中一共有17个常备师团（也称甲种师团），并且其中的大部分也都参加了侵华战争，而在这群侵略军中便包括日军第十六师团。由于该师团的司令部设于京都，并且官兵们也主要来自京都、三重县和奈良县，故而又被称之为“京都师团”。
七七全面抗战爆发后，日军大本营为了应对战争形势，于是便开始整军备战，而作为主力的第十六师团也由平时的18000人扩充到战时的约25000人。编制扩编完成后，第十六师团在中岛今朝吾的率领下于天津塘沽港登陆，编入日军华北方面军第二军的战斗序列之中，参加了子牙河等地区的战斗。后因淞沪会战爆发，第十六师团就又被编入上海派遣军战斗序列，由华北调往上海支援，然而正当中岛今朝吾所部即将抵达上海地区时，松井石根的部队已经提前攻下了上海，这让千里来增援却没放一枪一炮的第十六师团心里十分憋屈，于是为了安抚他们，作为总司令官的松井石根便让第十六师团追击正从上海溃退的国军部队。
上海失陷后，实力并没有受挫的第十六师团便一路追击进抵至南京东郊的紫金山一线，并在沿途的各村镇中烧杀淫掠，其暴行不胜枚举。南京保卫战打响后，第十六师团先是攻破了中山门，后又在轻型装甲车的配合下，从太平门外沿玄武湖一路打到南京城北的下关江边，以此来截断中国军队的退路。1937年12月13日，进入南京城的日军刻意制造了震惊中外的“南京大屠杀”，而在这起惨案中“下手最狠”的便是日军第十六师团。
由于天生便是嗜血残暴的“恶魔”，这个师团上至师团长、下至普通士兵不仅都不实行俘虏政策，反而还决定采取彻底消灭的方针，将投降的俘虏一个个全部杀死。除了虐杀俘虏，第十六师团还经常跑到国际安全区进行所谓的甄别搜捕，将头上有帽痕，手上有老茧的青壮年男子从难民中强行拉走，予以集体屠杀，更有一些毫无军纪可言的日军官兵还大肆强奸妇女、抢劫财物，而在这场浩劫中以“杀人竞赛”而臭名远扬被列为战犯遭处死的向井敏明和野田毅便是出自第十六师团。
由于南京的惨案震惊了全世界，日军大本营不得不召回了一批“刽子手”回国，而第十六师团也被紧急调回大连，重新编入“华北方面军”第二军的战斗序列之中。太平洋战争爆发后，第十六师团被编入进攻菲律宾的本间雅晴所统帅的日军第十四军，先后参加了第一、第二次巴丹半岛的攻坚战和菲律宾讨伐战，并在战后负责菲律宾的驻守任务。后来随着盟军反攻力度的加大，被日本人赶回老家的麦克阿瑟便决定杀回菲律宾，挽回自己丢失的尊严，而驻守在莱特岛的第十六师团也准备在菲律宾与美军决一死战。
1944年末，美军采用两面夹击的战术围歼第十六师团，致使该师团大部分有生力量被彻底消灭，仅只有少量官兵退至坎基伯特山继续进行游击战。虽然在热带雨林中饱受饥饿、疟疾、脱水的折磨，但逃进深山的第十六师团残部仍然会时不时地偷袭美军，直到日本投降后他们才放下武器，而该师团最后的幸存者也仅剩620人。值得一说的是，该师团在南京大屠杀中的首犯中岛今朝吾因为日本战败投降的因素，唯恐被作为战犯来华受审而忧郁得病，并最终于1945年10月25日病死，结束了自己可耻的一生。
