曾藝鵬 ， 胡 燕， 吳 平， 馮新格， 谷成英， 郭亞芳
（1. 上海市浦東醫院中醫科，上海 201399；2. 上海市浦東醫院檢驗科，上海 201399 ）
摘要：目的 探討患2型糖尿病的肥胖人群腸道菌群的變化特徵。方法 以21例患2型糖尿病的肥胖者作為研究組，21名血糖正常的肥胖志願者作為對照組。取研究組和對照組新鮮糞便，採用Illumina Miseq高通量測序平臺對糞便樣本中所有細菌的16S rRNA-V3區進行DNA測序，分析腸道菌群物種的丰度和分佈，並進行聚類分析。採用實時定量聚合酶鏈反應（PCR）對腸道菌群進行定量分析。結果 成功進行了DNA測序分析，樣本稀疏曲線顯示測序深度充分，測序覆蓋深度（Coverage指數）>0.99。研究組腸道菌群2個丰度指數（Ace和Chao1）均低於對照組（P<0.05），2個多樣性指數（Shannon和Simpson）分別低於和高於對照組（P<0.05）。實時定量PCR結果顯示，在門水平，研究組的厚壁菌門和放線菌門均低於對照組（P<0.05），而擬桿菌門高於對照組（P<0.05），其他2個菌門（變形桿菌門和梭形桿菌門）差異無統計學意義（P>0.05）；在屬水平，研究組的韋榮球菌屬、Ⅳ型梭菌屬和擬桿菌屬均高於對照組（P<0.05），而乳桿菌屬、Blautia球菌-直腸真桿菌屬、普雷沃菌屬和雙歧桿菌屬均低於對照組（P<0.05）。結論 患2型糖尿病的肥胖人群腸道菌群的丰度和多樣性下降，定量分析腸道菌群的構成對該人群有特殊意義。
關鍵詞：腸道菌群；2型糖尿病；肥胖； 高通量測序
2型糖尿病佔糖尿病患者人數的90%以上， 病，而環境被認為是導致其發病率增加的主要原是一種受遺傳和環境雙重因素影響的綜合性疾 因。2型糖尿病患者除有明顯的家族史外，肥胖是誘發糖尿病的主要環境因素。然而，大部分肥胖者可以一直保持血糖在正常範圍內。近年來，已有文獻報道腸道菌群與肥胖存在關聯[1-2]，同時有諸多文獻報道胰島素抵抗也是一種低級的炎症反應[3-4]，而胃腸道菌群兼具基因及環境雙重因素。研究患2型糖尿病的肥胖人群腸道菌群情況，可以為該病的發病機制提供進一步佐證，併為治療策略的制定和預後的評估提供參考。
材料和方法
一、研究對象
收集上海市浦東醫院門診就診的21例患2型糖尿病的肥胖者作為研究組，通過空腹糖耐量試驗確診。排除標準：年齡<18歲，患腸道器質性疾病，有腹部手術史，處於懷孕期或哺乳期，近2周內使用過膨脹劑、止瀉藥、解痙藥、益生菌及抗菌藥物。同時收集2 1名血糖正常的肥胖者作為對照組，經臨床體檢證實身體健康，無胃腸道症狀，近1個月內未服用任何抗菌藥物。
二、方法
1、樣本採集無菌條件下獲取研究對象自然排出的新鮮糞便，避開表面，採集中心部分糞便（10±5）g，放入無菌凍存管後立即速凍，採樣程序符合醫院倫理要求。糞便樣本送至實驗室，-80 ℃保存備用。
2、DNA提取採用QIAamp DNA Stool Mini Kit（德國QIAGEN公司）提取100 mg糞便樣本中微生物的總DNA，具體步驟按說明書操作。所提取的 DNA 用NanoDrop ND-1000分光光度計（美國Rockland公司）測定濃度後，於-80 ℃保存備用。
3、聚合酶鏈反應（p o l y m e r a s e c h a i n reaction，PCR）擴增及產物測序 用所提取的總DNA作為模板，16S rRNA PCR引物由測序接頭引物、Index和V3區引物3部分組成。Index為6 bp 核苷酸隨機組成的序列，以標記PCR產物的來源。PCR擴增體系共25 μL，其中2×Master Mix（NEB公司，美國）12.5 μL，引物各1.5 μL，模板2.5 μL，滅菌雙蒸水7 μL（如模板 DNA 濃度較低則不加滅菌雙蒸水，加等體積的模板）。擴增條件：98 ℃預變性30 s；98 ℃ 10 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，20個循環；最後 72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。反應結束後，將全部反應產物用 1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳（溴化乙錠染色）檢測擴增片段大小，採用QIAquick Gel Extraction Kit（德國QIAGEN公司）對目的條帶膠回收純化。將純化後的16S rRNA-V3區的PCR產物採用Illumina Miseq高通量測序平臺（美國Illumina公司）進行測序。
4、生物信息學分析 PCR產物採用Illumina Miseq高通量測序平臺進行高通量測序。隨後對高質量序列進行提取。提取方法：將Miseq測序得到的“PEreads”首先根據“overlap”關係進行拼接，將成對的“reads”拼接成一條序列，同時對“reads”的質量和“merge”的效果進行質量控制和過濾，去除序列末端的後引物和接頭序列、多鹼基N、polyA/T尾巴及低質量鹼基；去除所得序列的“barcode”標籤序列、前引物序列；丟棄長度短於200 bp、模糊鹼基數>0、序列平均質量<20的序列。高質量序列的生物信息學分析：（1）操作單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析。提取非重複序列，使用QIIME數據處理平臺進行序列的生物信息學分析，與silva數據庫中已比對的序列數據庫的參考序列進行比對，將相似性在97%以上的序列進行歸併，生成分類OUT。（2）菌群多樣性分析。根據OTU聚類分析結果進行alpha和beta多樣性計算，採用丰度指數（Ace、Chao1）和多樣性指數（Simpson、Shannon）分別對樣本進行分析。（3）稀疏曲線分析。採用 R軟件在97%相似性水平繪製樣本稀疏曲線，
比較測序數量不同的樣本物種的豐富度並評估樣本的取樣大小是否合理。（4）菌群分類學分析。採用R軟件將OTU中全部序列與silva數據庫中的參考序列進行比對，找出其最相近且可信度達80%以上的種屬信息。並將每一個OTU中的所有序列進行類比，找出同一OTU中的不同序列最相近祖先的種屬信息。根據silva數據庫中的參考序列對OTU進行種屬鑑定。（5）菌群群落結構分析。根據菌群分類學分析比對結果，對樣本群落結構進行菌群種類和豐度分析。
5、實時熒光定量PCR 採用ABI實時定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）對腸道中最常見的細菌分別進行定量檢測。PCR均採用25 μL反應體系，包括2×PCR Mix、2 U Taq DNA聚合酶、0.2 mmol/L dNTP、正向和反向引物各0.1 μmol/L以及 5 μL DNA模板。反應程序：95 ℃1 min；95 ℃ 25 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，40個循環。熒光定量PCR均以濃度101～108拷貝/μL 的標準菌種16S rRNA基因片段的質粒DNA構建標準曲線，用每克糞便16S rRNA基因拷貝數的對數值表示2個組別所有個體細菌數量。樣本定量數據經log10轉換後錄入SPSS 17.0統計軟件並進行統計分析。PCR引物序列見表1。
三、 統計學方法
採用SPSS 17.0軟件進行統計分析。一般計數資料進行χ2檢驗，組間和組內相似性係數等計量資料結果以x±s表示，進行t檢驗，Dice相似性係數採用UPG-MA方法計算。以P<0.05為差異有統計學意義。
結 果
一、研究對象的一般情況
通過問卷調查發現，研究組和對照組間飲食習慣及戶外鍛鍊情況差異無統計學意義（ P>0.05）。除空腹血糖、糖化血紅蛋白及空腹胰島素水平2 個組間差異有統計學意義（P<0.05）外，其他指標差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。
二、菌群群落結構分析
通過序列分析，在菌門水平上研究組和對照組樣本主要包含5個菌門，其中厚壁菌門與擬桿菌門之和約佔90%，變形桿菌門、放線菌門和梭形桿菌門各佔1%～5%。擬桿菌門的序列主要是擬桿菌綱，厚壁菌門的序列主要是梭菌綱，其他還有產芽孢菌和芽孢桿菌，分別佔所有序列的7%和2%。
樣本稀疏曲線是統計研究對象所代表的物種數目，並以個體數和物種數來構建的曲線，其可以用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理。本研究樣本的稀疏曲線見圖1，在序列數<2 000條時，樣本稀疏指數隨序列數增加而迅速增加，在序列數>6 000條時，樣本稀疏指數增加緩慢之後則進入平臺期。大部分樣本的稀疏曲線趨於平緩，這表示樣本中大部分的物種都被檢測到。對照組樣本稀疏指數範圍為52～221，而研究組樣本稀疏指數範圍為47～162。
三、腸道菌群丰度及多樣性分析
通過1 6 S r R N A - V 3 區的深度測序，經9 7 % 相似性歸併後研究組和對照組的測序覆蓋深度（Coverage指數）>0.99。對照組患者Reads指數（23 454.33±2 224.89）略高於研究組（22 921.45± 1 258.76），但差異無統計學意義（P=0.057 6）。2個組研究對象所獲得的OTU差異有統計學意義（P=0.000 0）。
Ace 或Chao1 越大說明菌群丰度越高，對照組的Ace 和Chao1 分別是（209 . 77 ± 32 . 21 ）和（2 2 5 . 5 4 ± 4 3 . 5 5 ），而研究組分別為（119.09±24.91）和（187.49±36.42），2個組差異有統計學意義（P<0.05）。Shannon越大或Simpson 越小表明群落多樣性越強，對照組Shannon和Simpson分別為（3.23±0.89）和（0 . 0 8 8 7 ± 0 . 0 5 01 ），研究組分別為（2.39±0.76）和（0.128 7±0.071 2），2個組差異有統計學意義（P<0.05）。對照組Shannon範圍為2.71～4.09，而研究組Shannon範圍為1.32～3.65。見表3、圖2。
四、實時熒光定量PCR
通過實時熒光定量PCR發現，在門水平，研究組的厚壁菌門、擬桿菌門及放線菌門與對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），而變形桿菌門和梭形桿菌門差異均無統計學意義（P>0.05）。研究組的厚壁菌門和放線菌門較對照組顯著下降（P<0.05），而擬桿菌門顯著上升（P=0.00）。同時，研究組厚壁菌門/擬桿菌門比值顯著下降（P=0.00）。見表4。
在厚壁菌門中，研究組的韋榮球菌屬和Ⅳ型梭菌屬較對照組顯著上升（P=0.00），而乳桿菌屬和Blautia球菌-直腸真桿菌屬則顯著下降 （P<0.05）。在擬桿菌門中，研究組的擬桿菌屬較對照組顯著上升（P=0.00），而普雷沃菌屬則顯著下降（P=0.01）。在放線菌門中，研究組的雙歧桿菌屬較對照組顯著下降（P=0.00）。見表5。
討 論
近年來，有研究認為腸道菌群的改變與包括肥胖、糖尿病等代謝性疾病及心血管疾病的發生有關聯[2]。利用高通量測序技術研究腸道菌群能夠克服常規培養方法的缺陷，發現低丰度細菌或未知細菌，進而可全面、準確地獲得菌群的信息。國內外已有學者採用高通量測序技術對2型糖尿病患者的腸道菌群進行分析，發現2型糖尿病患者腸道菌群的種類和數量與正常人存在差異[5-6]。然而肥胖作為2型糖尿病的一個重要環境因素，上述研究並未對其進行考量和分析。因此，對患2型糖尿病的肥胖人群體內腸道菌群進行分析有一定的臨床意義。
從腸道菌群群落丰度和結構上看，本研究對照組腸道菌群丰度和多樣性均高於研究組。腸道菌群丰度和結構可代表消化道菌群的基本狀況，本研究結果說明對照組腸道菌群的物種總數高於研究組。在一項大樣本研究中，研究者利用高通量測序技術對人類腸道菌群進行分析，認為腸道菌群基因丰度可作為代謝性疾病的標誌物[7]。該研究發現人群腸道細菌基因數分佈呈雙峰樣，特別是在肥胖人群中雙峰分佈明顯，而正常對照呈單峰樣。我們推測“雙峰”可能代表了不同的人群，正如本研究中研究組人群代表了“低丰度”人群，而對照組人群代表了“高丰度”人群。COTILLARD等[8]也發現了這一現象，他們同時通過飲食干預對低丰度人群進行了干預，結果顯示丰度的提高伴隨著代謝紊亂的改善。這些研究成果為患2型糖尿病的肥胖人群的臨床治療打開了一扇窗。
在初步瞭解研究對象腸道菌群的丰度和結構後，本研究進一步對腸道菌群的種群進行了分析。人類腸道菌群種類繁多，從門的水平上可分為5大類，包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、放線菌門和梭形桿菌門，其中約90%由厚壁菌門和擬桿菌門構成。本研究結果顯示，厚壁菌門和擬桿菌門是2組人群腸道中的主要菌群，只是在構成比上存在差異。定量分析結果顯示，研究組擬桿菌門顯著上升而厚壁菌門顯著下降。在腸道菌群中，厚壁菌門和擬桿菌門比例的不平衡與許多疾病相關。有研究認為肥胖人群厚壁菌門佔優勢，厚壁菌門/擬桿菌門比值較高[1]；也有研究認為糖尿病患者擬桿菌門佔優勢，而厚壁菌門/擬桿菌門比值較低[9]。上述研究顯示單純肥胖者和糖尿病患者的腸道菌群結構存在差異，而本研究結果顯示患2型糖尿病的肥胖人群似乎更傾向於糖尿病患者的腸道菌群特點。同時，本研究還發現放線菌門在2個組間也有差異（P=0.02）。
以往研究顯示，腸道菌群可促進蛋白質、糖類等物質的吸收，把難吸收的多糖轉變為單糖，參與膽固醇的代謝等，對腸道內營養物質的代謝具有重要的干預作用[2，10]。我們通過文獻檢索，對7個目標菌種利用實時熒光定量PCR進行分析，結果發現在研究組中擬桿菌屬、Ⅳ型梭菌屬和韋榮球菌屬顯著上升，而乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、Blautia球菌-直腸真桿菌屬和普雷沃菌屬則顯著下降。乳桿菌屬和雙歧桿菌屬能產生乳酸，具有益生菌的特點。動物實驗結果顯示，高水平的乳桿菌屬和雙歧桿菌屬具有抵抗糖尿病的作用，而擬桿菌屬和Ⅳ型梭菌屬能促進糖尿病的形成[11]。細菌產生的乳酸能被腸道內另一類產丁酸的細菌利用，進而轉化成丁酸[12]，丁酸能促進腸道合成黏蛋白，保護腸黏膜的完整性。Blautia球菌-直腸真桿菌屬是一個主要的產丁酸菌種，而普雷沃菌屬的作用主要是降解黏蛋白。擬桿菌屬、Ⅳ型梭菌屬和韋榮球菌屬可以利用葡萄糖和乳酸最後分解成短鏈脂肪酸[13]，但是這些短鏈脂肪酸並不能合成黏蛋白，反而能導致腸道黏膜的通透性增加，促進炎症的形成[12]。這些對特定菌種的研究成果為我們利用腸道菌群靶向治療2型糖尿病奠定了基礎。
肥胖是2型糖尿病的高危因素，本研究通過對患2型糖尿病的肥胖人群的腸道菌群進行分析，發現了在此類人群中腸道菌群的一些特異性變化，為預防和臨床治療2型糖尿病拓展了視野。然而，本研究雖然考慮了飲食及體育鍛煉等因素，但腸道菌群還受年齡、地域等因素影響，因此多中心、大樣本的研究是非常有意義的，同時腸道菌群變化與2型糖尿病的因果關係還需進一步探索。
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