原創 莫沉 微生態 2019-09-04
導讀
本文中，研究者選用4周齡C57BL/6J雄性小鼠，構建高脂飼料誘導的肥胖模型，研究葉綠素的補充對小鼠早期肥胖的抑制作用。研究發現，補充葉綠素可以有效延緩高脂飼料餵養的小鼠體重增加，同時可以改善葡萄糖耐量，減少炎症發生。膳食中補充葉綠素緩解肥胖相關指標的作用機制可能與葉綠素對腸道菌群組成的改變有關，研究者發現Blautia 以及norank_f_Bacteroidales_S24-7_group的相對丰度有所增加，而Lactococcus 以及 Lactobacillus的相對丰度則有所下降。
論文ID
原名：Chlorophyll supplementation in early life prevents diet-induced obesity and modulates gut microbiota in mice
譯名：早期補充葉綠素可預防飲食引起的肥胖並調節小鼠腸道菌群
期刊：Molecular Nutrition & Food Research
IF： 4.653
發表時間：2019年
通信作者單位：中國農業大學食品科學與營養工程學院
結果
1 早期補充葉綠素可降低高脂飼料餵養小鼠的體重和脂肪積累
通過構建膳食誘導肥胖模型，圖1所示，與正常飼料餵養小鼠相比，在高脂飼料餵養13周後，小鼠的體重、白色脂肪組織堆積均顯著增加。高脂飼料餵養13周小鼠平均增重20.06 g，而葉綠素干預組13周小鼠的平均增重僅為15.94 g，該結果表明早期補充葉綠素可以顯著抑制肥胖體重增加。接著，研究者從各組實驗小鼠中分離出三種類型的白色脂肪組織，分別為附睪內臟脂肪組織(epididymal visceral adipose tissue ,Epi-WAT)、腎周白色脂肪組織(perirenal white adipose tissue, Per-WAT) 以及腹股溝皮下脂肪組織(inguinal subcutaneous adipose tissue,Ing-SAT)。與體重增加的結果一致，高脂飼料餵養的小鼠體內三種類型的脂肪組織重量均顯著增加，而葉綠素補充則可以改善上述小鼠的體重增加。此外，本研究中，研究者發現早期補充葉綠素可以改善肥胖小鼠在成年期潛在的超負荷的體重增加，同時對飼料餵養小鼠的能量攝入沒有顯著影響。
圖1 早期補充葉綠素可以降低高脂飼料餵養小鼠的體重和脂肪積累。A. 體重變化； B. 脂肪組織重量: 附睪內臟脂肪組織 (epididymal visceral adipose tissue, Epi-WAT)，腎周白色脂肪組織 (perirenal white adipose tissue, Per-WAT), 腹股溝皮下脂肪組織 (inguinal subcutaneous adipose tissue, Ing-SAT)；C. 總能量的攝入；D. 能量效率，即體重增加和能量攝入的比值。
2 早期葉綠素的干預調節高脂飼料餵養肥胖小鼠的血脂水平
由於肥胖常常與血脂水平異常密切相關，因此研究者測定了實驗各組小鼠的血脂水平。表1所示，與正常小鼠相比，高脂飼料餵養的肥胖小鼠出現明顯的血脂異常症狀，血漿甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(triglyceride, TC)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)水平顯著升高，而葉綠素干預組小鼠血清TG (p<0.001)、TC (p<0.01)、LDL (p<0.01)均顯著下降。此外，在高脂飼料誘導13周的肥胖小鼠中添加葉綠素可以顯著抑制血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT, p<0.001)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH, p<0.05)的升高，但與正常飼料餵養的小鼠相比無顯著性差異。上述結果表明，早期補充葉綠素可改善高脂飼料誘導肥胖小鼠的血脂異常。
表1. 早期葉綠素的干預對高脂飼料餵養肥胖小鼠的血脂水平的影響。
3 早期補充葉綠素降低高脂飼料餵養小鼠肥胖相關代謝指標及糖耐量
相關研究表明，肥胖症常伴隨著全身性的輕度炎症和脂肪組織炎症。TNF-a是一個重要的促炎細胞因子，而內毒素 (lipopolysaccharide, LPS)則控制著目標組織促炎細胞因子的分泌,導致肥胖小鼠慢性炎症。圖2中，經過13周高脂飼料的誘導，導致肥胖小鼠血清TNF-a和LPS水平與正常飼養小鼠相比顯著增高。早期飲食葉綠素的干預可以顯著降低血清LPS (p < 0.001)和TNF-a (p < 0.001) 水平。此外，為了研究葉綠素的降血糖作用，研究者測定了實驗各組小鼠的空腹血糖水平，結果發現，與正常飼養小鼠相比，高脂飼料誘導的肥胖小鼠空腹血糖水平顯著升高，而葉綠素的補充對小鼠的空腹血糖有明顯抑制作用。此外，研究者同時進行了腹腔注射葡萄糖耐量試驗(IPGTT)，統計了0-120 min的積分曲線下面積(AUC)，結果發現，在同一時間節點，高脂飼料誘導的肥胖小鼠血糖水平顯著高於正常飼料餵養組。從注射之後的第15分鐘到120分鐘，尤其是在注射後第30分鐘，葉綠素干預可顯注降低肥胖小鼠的血糖水平，同時減小AUC值(15.43%, p<0.001)。
圖2早期補充葉綠素降低高脂飼料餵養小鼠肥胖相關代謝指標及糖耐量。A. 血清內毒素水平; B. 血清TNF-α水平; C. 空腹血糖；D. 血糖水平變化曲線及曲線下的計算面積。
4 早期補充葉綠素對高脂飼料餵養小鼠腸道菌群多樣性、豐富性和結構的影響
生命早期是宿主-菌群代謝相互作用的關鍵時期，因此本研究聚焦在生命早期攝入葉綠素是否會導致腸道菌群結構的特異性改變。經過13周的餵養，研究者對實驗各組小鼠的糞便樣品進行多樣性分析，對菌群的豐富度(Sobs index)和多樣性(Shannon index)進行統計分析。研究發現，早期葉綠素補充對實驗小鼠腸道菌群的豐富度(圖3A, p < 0.01)和多樣性(圖3B, p < 0.001)均有顯著影響。PCoA 分析顯示，不同處理組間的菌群組成結構都有明顯的聚類，這表明實驗小鼠的腸道菌群結構在高脂餵養和葉綠素補充的作用下發生了較為顯著的變化(圖3C)。
圖3 早期補充葉綠素改善高脂飼料餵養小鼠腸道菌群多樣性、豐富性和結構的影響. A. Sobs指數; B. Shanon指數; C. 在OUT水平上基於Bray-Curtis 的 PCoA 分析。
5 早期補充葉綠素對高脂飼料餵養小鼠腸道菌群組成的影響
接下來，研究者進一步分析了測序篩選出的優勢類群的相對丰度變化。圖4A所示為實驗各組小鼠腸道細菌在門水平上的組成變化，其中厚壁菌門和擬桿菌門的變化較為顯著。與正常飼料餵養小鼠相比較，高脂飼料餵養可顯著增加Firmicutes, Saccharibacteria 以及 Tenericutes的相對丰度，而葉綠素的早期干預可以一定程度上逆轉上述變化，降低F/B的比例。與此同時，葉綠素的早期干預可以顯著增加Bacteroidetes 以及 Proteobacteria的相對丰度。此外，研究者還在屬水平上對各組的菌群進行差異分析，發現高脂飼料餵養組中no-rank_f_Bacteroidales S24-7 group, Allobaculum, Faecalibaculum, 以及Bifidobacterium 的相對丰度有所升高，而Lactobacillus 以及Lactococcus 的丰度有所上升。然而，在在添加葉綠素干預的高脂飼料餵養組小鼠中，上述變化被恢復到與正常飼料餵養的小鼠相似的水平（圖4B）。此外，早期補充葉綠素可以顯著增加Blautia, no rank_f_Lachnospiraceae, Helicobacter, 以及Odoribacter 的相對丰度（圖4C）。
圖4早期補充葉綠素改善高脂飼料餵養小鼠腸道菌群組成的影響. A. 在門水平上群落丰度的百分比; B. F/B比例; C. 在屬水平上群落丰度的百分比。
6 早期補充葉綠素對高脂飼料餵養肥胖小鼠腸道菌群的核心差異菌群的影響
圖5所示，正常飼料餵養的小鼠具有較高的益生菌菌株數量，例如，no rank_f_Bacteroidales S24-7 (Bacteroidales S24-7科，Bacteroidales目，Bacteroidia綱，Bacteroidetes門)，Allobaculum (Erysipelotrichacea科，Erysipelotrichale目，Erysipelotrichia綱，Firmicutes門)。經過葉綠素的早期補充可以顯著增加高脂飼料餵養小鼠中no rank_f_Bacteroidales S24-7，Blautia的相對丰度，這一發現與之前其他人的研究結果相一致。
圖5 早期補充葉綠素影響高脂飼料餵養肥胖小鼠腸道菌群的核心差異菌群. A. LEfSe分析顯示了分類單元之間的層級關係(層次表示，從內環到外環依次為門、綱、目、科和屬); B.高脂飼料餵養組與葉綠素干預組腸道菌群的LDA分析(評分為>3，條形圖長度代表LDA評分)。
7 腸道菌群與肥胖相關代謝指標的相關性分析
通過Spearman相關性熱圖分析進一步探討菌群組成變化與肥胖相關指標之間的關係。圖6所示，相關性熱圖顯示Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Candidatus Saccharimonas, Enterorhabdus, 以及Ruminococcaceae UCG-010 的相對丰度與肥胖相關指標的顯著正相關性，而norank_f_Bacteroidales S24-7 group, unclassified_f_Erysipelotrichaceae, Allobaculum的相對丰度與肥胖相關指標的顯著負相關。相關研究報導，Bacteroidales S24-7 以及Ruminococcaceae含有多種產丁酸鹽菌，具有抗炎活性，對宿主健康具有潛在的生理功能。
圖6 腸道菌群與肥胖相關代謝指標的相關性分析. Spearman相關性熱圖分析了50個關鍵菌株的相對丰度和體重、甘油三酯、空腹血糖(Glucose 1)及30分鐘的血糖(Glucose 2)，血清脂多糖(LPS)及TNF-α水平之間的相關性. 圖中顏色範圍從綠色(負相關)到紅色(正相關)。
8 早期葉綠素干預對腸道菌群代謝譜的影響
研究者基於得到的16S rRNA 測序數據對實驗小鼠腸道菌群代謝譜的變化進行預測分析。經過葉綠素的早期干預，有14個COG 通路發生顯著改變。其中，研究聚焦氨基酸的轉運和代謝、核苷酸轉運與代謝，翻譯、核糖體結構與生物合成、碳水化合物運輸和代謝、信號轉導機制以及轉錄相關通路。雖然代謝途徑涉及氨基酸、核苷酸、碳水化合物的運輸和代謝，上述數據並不排除葉綠素對菌群代謝譜有其他直接影響的可能性。葉綠素可能通過多種方式來調節腸道菌群來預防高脂飲食誘導的肥胖。
圖7 早期補充葉綠素對腸道菌群代謝的影響. 對16S rRNA 測序數據進行進一步的PICRUSt 分析（NC = 8, HFD = 8, HFCHL = 8）。
結論
研究發現，早期補充葉綠素可以有效延緩高脂飼料餵養的小鼠體重增加，同時可以改善葡萄糖耐量，減少炎症發生。在高脂飼料誘導的肥胖小鼠模型中，當葉綠素早期攝入劑量為18 mg/kg 時，可有效緩解肥胖小鼠體重增加、白色脂肪組織堆積、血清脂質水平、葡萄糖耐量、血清內毒素及TNF-a等肥胖相關代謝指標。此外，研究者發現膳食中補充葉綠素緩解肥胖相關指標的作用機制與調節腸道菌群組成有關，可提高Blautia 以及norank_f_Bacteroidales_S24-7_group的相對丰度，同時降低Lactococcus 以及 Lactobacillus的相對丰度。
評論
近年來，超重和肥胖，在年輕一代中越來越普遍。根據世界衛生組織的統計數據，截止2014年，超過19億年輕人超重，其中超過6億人肥胖。肥胖是一些代謝併發症的重要危險因素，如2型糖尿病、血脂異常、高血壓、心血管疾病、中風、膝骨關節炎和某些癌症。從出生到3歲這段時間對於兒童的生長和健康是至關重要的，在這一階段兒童早期形成的飲食習慣可能會影響以後的飲食偏好並導致肥胖的發生。因此，早期的營養干預具有很大的潛力，同時作為一種預防性措施來降低肥胖的風險和改善代謝健康具有重要意義。此外，早期生命是新陳代謝發展的關鍵時期，生命早期腸道菌群的破壞可能導致身體成分的改變，這與兒童超重和代謝紊亂的風險增加有關。
一直以來，綠色蔬菜被認為對健康有益，歸因於其豐富的營養和多種對人體健康有益的物質。儘管蔬菜的攝入對健康有好處，但是關於其中的具體營養成分的認識仍然十分有限。葉綠素是蔬菜中最常見的天然色素之一，相關研究報道，其在預防慢性疾病，如冠心病，某些癌症，糖尿病和白內障方面有保護作用。例如，有研究發現，與高脂肪餵養的小鼠相比，飲食中添加葉綠素可以抑制食物攝入、減少體重增加和身體脂肪堆積。然而，目前還沒有相關研究報道，從嬰兒期攝入葉綠素與成年期肥胖之間的關係、葉綠素的補充對高脂肪飲食誘導肥胖的影響，以及葉綠素的早期干預與腸道菌群相關的變化情況。因此，本研究採用4周齡小鼠，構建高脂飼料誘導肥胖模型，研究早期補充葉綠素對肥胖及其相關代謝指標的緩解作用。結果表明在葉綠素早期攝入量為(0.18 mg/10 g 體重)時，可有效緩解肥胖相關代謝指標，例如體重、白色脂肪組織堆積、血清脂質參數、葡萄糖耐量、血清內毒素及TNF-a水平。同時發現，日常補充葉綠素的上述有益作用可能與腸道菌群組成的改變有關，通過增加norank_f_Bacteroidales_S24-7_group以及Blautia 的相對丰度，同時降低Lactococcus 和Lactobacillus的相對丰度。然而，葉綠素在生命早期是如何調控特定的代謝相互作用，並確定這些變化是否在機體的代謝中起關鍵作用仍然需要後續進一步的研究。
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