原創 Jione、song 微生態 2019-11-09
導讀
腸道適應性免疫細胞是腸道組織穩態的關鍵因素，而且B細胞衍生的免疫球蛋白A（IgA）在腸道功能的建立中起到關鍵作用，T細胞非依賴性（TI）IgA識別大部分腸道微生物，T細胞依賴性（TD）IgA的誘導物種只有少數能被鑑定。為了研究一種與宿主代謝和PD-1檢查點免疫療法的全身影響相關的腸道細菌阿克曼氏粘蛋白降解菌(Akkermansia muciniphila)在誘導小鼠腸道細胞產生免疫球蛋白G1（IgG1）抗體和抗原特異性T細胞應答中的作用，科研人員構建了兩種小鼠模型以模擬不同的腸道環境，通過對CD4和T細胞進行示蹤標記以測定T細胞的功能，並用產生的I-Ab四聚體檢測了所有腸相關的淋巴組織，對比於無病原體的小鼠，阿克曼粘蛋白降解菌小鼠引起更大的IgG1應答變異性，並且表徵了常規條件下阿克曼粘蛋白降解菌的T細胞應答。研究結果顯示阿克曼氏粘蛋白降解菌可以引起強烈的T細胞免疫應答，而且本研究結果確定了一個具有臨床意義的重要目的，即共生體特異性T細胞應答可能偏向不同方向的機制。
論文ID
原名：Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis
譯名：Akkermansia muciniphila粘蛋白降解菌在體內穩態下引發的腸道適應性免疫反應
期刊：Science
IF：41.037
發表時間：2019.5
通訊作者：Gregory M. Barton
通訊作者單位：美國華盛頓西雅圖癌症研究中心基礎醫學部
實驗設計
本文首先參照先前的研究方法利用小鼠血清和糞便二抗染色樣品來見檢查糞便中共生細菌與血清抗體的結合情況。從染色的糞便樣品中分選出了IgG1結合和未結合的抗體以鑑定體液應答靶向的共生生物，並進行了16srDNA的測序分析，將結果IgG1陽性的糞便進行培養以分離出阿克曼氏粘蛋白降解菌進行後續的實驗，並參照先前對依賴性免疫IgG1應答的能力和其對宿主生理學作用的報道，初步表徵該種細菌引起的免疫應答。首先，使用流式細胞術分析了穩態下小鼠阿克曼氏粘蛋白降解菌陽性細胞中存在的該菌特異性IgG1抗體，並且比較了阿克曼氏粘蛋白降解菌陽性和陰性小鼠之間的IgG1抗體的應答差異。基於先前對阿克曼氏粘蛋白降解菌血清IgG1應答滴度在阿克曼氏粘蛋白降解菌重視可變的這一認知，但少數小鼠缺乏特異性抗體IgG1。後續研究人員為了確定黏膜免疫系統是否由阿克曼氏粘蛋白降解菌直接參與TD（T細胞依賴性）IgG1反應的基礎，建立了一個確定的生殖系統，並且進一步探索了T細胞對阿克曼氏粘蛋白降解菌的反應，擴增了定殖阿克曼氏粘蛋白降解菌小鼠的腸細胞的T細胞系，利用雜交瘤細胞構建了轉基因小鼠的模型。用先天性標記的CD4和T細胞以追蹤T細胞對阿克曼氏粘蛋白降解菌的響應。內源性的阿克曼是粘蛋白降解菌特異性T細胞的追蹤從外膜蛋白開始，產生了I-Ab四聚體，最後用四聚體探測了所有腸相關的淋巴組織，對比無病原體的小鼠，阿克曼粘蛋白降解菌小鼠引起更大的IgG1應答變異性，並且表徵了常規條件下阿克曼粘蛋白降解菌的T細胞應答。
結果
通過用配對小鼠血清和同種型特異性二抗染色糞便樣品來檢查血清抗體與完整共生細菌的結合。令人驚訝的是，比較野生型（WT）和T細胞缺陷（Tcrb- /-）小鼠顯示小鼠產生微生物群反應性IgG1抗體完全依賴於αβ T細胞（圖1，A和B，圖S1，A至C），如先前報道的那樣（圖S1A），以TI的方式誘導抗血清IgG2b，IgG3和IgA。由TD IgG1結合的共生組分為~10％（圖1B），遠小於IgA，IgG2b和IgG3識別的百分比（圖S1A）。因此，與結合多種細菌的多反應性TI抗體相比，小鼠產生的IgG1似乎僅識別腸中的一部分微生物。將足夠的T細胞（Tcrb+/-）和Tcrb-/-攜帶的同窩仔畜與微生物群的組成對照進行比較，並且僅在Tcrb +/-小鼠中發現抗血清IgG1應答（圖S1B）。此外，對來自多個供應商和不同遺傳背景的小鼠的分析表明，該IgG1應答是健康小鼠的一般特徵（圖1C）。
圖1 小鼠在體內平衡期間產生抗血清IgG1抗體。
為了鑑定這種體液應答靶向的共生物種，從相應小鼠血清染色的糞便樣品中分選IgG1結合和未結合群體（圖S2，A和B），並對結果部分進行16SrDNA測序。與IgG1陰性組分相比，在IgG1陽性級分中顯著富集的OTU的分析揭示了兩個主要的IgG1靶標（圖1D和圖S2，C和D）。這些OTU對應於阿克曼西亞屬（OTU2）和擬桿菌屬S24-7家族（OTU63）。阿克曼西亞是疣微菌門的共生屬，它只包含一個成員阿克曼氏粘蛋白降解菌。阿克曼氏粘蛋白降解菌可以降解粘蛋白，並且是人類腸道微生物群的豐富成員。據報道，用阿克曼氏粘蛋白降解菌定殖對飲食誘導的肥胖具有保護作用，促進粘膜傷口癒合，並在抗PDD-1免疫治療期間增加抗腫瘤反應。阿克曼氏粘蛋白降解菌介導這些不同作用的機制仍然知之甚少，因為對這種細菌的宿主感知知之甚少。因此，基於阿克曼氏粘蛋白降解菌誘導TD IgG1應答的能力及其對宿主生理學的報道的影響，本文試圖表徵對該細菌的免疫應答。
通過在選擇性培養基上鋪板糞便從菌落中的分離出小鼠的阿克曼氏粘蛋白降解菌。然後使用細菌流式細胞術分析來確認在穩態下攜帶阿克曼氏粘蛋白降解菌的小鼠血清中存在的阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性IgG1抗體（圖2A）。這些針對阿克曼氏粘蛋白降解菌的IgG1抗體應答可以由預先存在的天然多反應性特異性組成，或者可以是抗原特異性的。為了區分這些可能性，我們在其微生物群中鑑定了缺乏阿克曼氏粘蛋白降解菌的C57BL/6小鼠（圖2B）。比較阿克曼氏粘蛋白降解菌陰性和陽性小鼠之間的IgG1抗體應答證實，阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性血清IgG1應答的誘導需要用阿克曼氏粘蛋白降解菌以及T細胞定植（圖2，A至C，和圖S3A）。阿克曼氏粘蛋白降解菌陽性小鼠也含有血清阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性TD IgA應答（圖S3B）。此外，通過口服強飼法從頭定殖阿克曼氏粘蛋白降解菌陰性小鼠足以誘導阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性IgG1抗體（圖2，D至F和圖S3C）。因此，對阿克曼氏粘蛋白降解菌的IgG1應答不是來自先前存在的交叉反應特異性。相反，小鼠在阿克曼氏粘蛋白降解菌定植時產生抗原特異性TD IgG1抗體應答。
圖2 阿克曼氏粘蛋白降解菌對於誘導同源阿克曼是粘蛋白降解菌特異性IgG1抗體應答是必要且足夠的
針對阿克曼氏粘蛋白降解菌的血清IgG1的應答在阿克曼氏粘蛋白降解菌陽性小鼠中是可變的。儘管有相似的定植，但少數小鼠完全缺乏阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性IgG1（圖2，B和C，以及圖S3A）。對這種可變性的一種解釋是腸道微生物群落內的變異可能改變對阿克曼氏粘蛋白降解菌的反應。事實上，先前的研究表明腸道感染或炎症可導致旁觀者對共生微生物的反應改變。為了克服這些困難，本文建立了一個確定的生殖系統，以確定粘液免疫系統是否由阿克曼氏粘蛋白降解菌直接參與TD IgG1反應的基礎。為此，我們將阿克曼氏粘蛋白降解菌引入了用植物瓊脂（ASF）改變定殖的無菌 C57BL / 6小鼠（24,25），除了ASF + Akk菌落中存在阿克曼氏粘蛋白降解菌，以產生具有相同微生物群的兩個小鼠群體。阿克曼氏粘蛋白降解菌將ASF + Akk小鼠定植至高水平並垂直傳播（圖2G和圖S3D）。將所有分析限制在通過垂直傳播獲得阿克曼氏粘蛋白降解菌的ASF + Akk小鼠的後代（或後代的後代）。用ASF + Akk菌群定殖的小鼠，但不是單獨的ASF菌群，對阿克曼氏粘蛋白降解菌具有特異性的IgG1和IgA抗體應答，在小鼠之間非常一致（圖2，H和I）。阿克曼氏粘蛋白降解菌直接參與免疫系統以誘導TD IgG1和IgA。
為了探索T細胞對阿克曼氏粘蛋白降解菌的反應，本文從阿克曼氏粘蛋白降解菌定殖小鼠的腸組織中擴增阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性T細胞系，並通過與BWZ.36細胞融合產生T細胞雜交瘤（圖S4， A和B）。通過篩選阿克曼氏粘蛋白降解菌基因組表達文庫來鑑定刺激每種T細胞雜交瘤的克隆（圖S4，C至E），鑑定了這些雜交瘤中的兩種（124-2和168-H10）識別的抗原。124-2雜交瘤識別衍生自Amuc_RS03735的肽，Amuc_RS03735是含有外膜的自轉運蛋白結構域的蛋白質。接下來，我們使用來自124-2T細胞雜交瘤的TCRa和TCRb鏈產生了阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性T細胞受體（TCR）-轉基因小鼠（Amuc124）（圖S4A和S5，A和B）。重要的是，後續將不含阿克曼氏粘蛋白降解菌定植的Amuc124小鼠用於所有後續實驗。
通過將幼年的、先天性標記的（Thy1.1）Amuc124 CD4+T細胞低頻轉移到ASF和ASF + Akk小鼠中來追蹤T細胞對阿克曼粘蛋白降解菌的反應（圖S6A）。阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性T細胞在ASF + Akk小鼠中擴增，但在ASF小鼠中檢測不到，表明阿克曼氏粘蛋白降解菌抗原在穩態條件下呈現（圖3，A和B;圖S6，A和B;和圖.S3A）。Amuc124 T細胞定位於Peyer's淋巴結（PPs）和腸繫膜淋巴結（mLNs），但在大腸或小腸固有層（分別為LILP或SILP）中發現極少數細胞（圖3，A和B，以及圖S6B）。大多數轉移的T細胞表達T濾泡輔助細胞（TFH）細胞標誌物PD-1，Bcl6和CXCR5（圖3C至E，以及圖S6，C和D），其中一小部分採用調節性T細胞（Treg）標記FOXP3。在LP中可檢測的少量T細胞也傾向於TFH細胞表型，最可能表明二級或三級淋巴組織未完全排除在這些製劑之外（圖3F）。轉移Rag1+/+或Rag1-/-的Amuc124 T細胞產生類似的結果（圖S7，A至D）。令人驚訝的是，轉移的T細胞表達T輔助細胞1（TH1），TH2或TH17細胞（分別為T-bet，GATA3或RORgt）的標記物未被檢測到可觀的數量（圖S6D）。
圖3 阿克曼氏粘蛋白降解菌在體內平衡期間誘導抗原特異性TFH細胞應答
為了追蹤內源性阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性T細胞，我們從外膜蛋白Amuc_RS03735產生了載有肽TLYIGSGAILS（Thr-Leu-Tyr-Ile-GlySer-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser）的I-Ab四聚體（Am3735-1）（圖S4，C至F）。在ASF + Akk的PPs中鑑定出內源性，四聚體陽性的阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性T細胞，而不是ASF小鼠（圖3，G和H），與過繼轉移後用Amuc124 T細胞獲得的結果一致。此外，通過四聚體染色鑑定的內源性阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性T細胞也表達TFH細胞標記物（圖3，I和J）。具有來自Amuc_RS03740（Am3740-1）的不同阿克曼氏粘蛋白降解菌表位的獨立四聚體產生非常相似的結果（圖3，H至J）。最後，用四聚體探測了所有腸相關淋巴組織（LILP，PPs和SILP）和mLNs。在PP中檢測到阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性T細胞，但在LP中沒有檢測到（圖3K），這證實了用Amuc124T細胞轉移獲得的結果。因此，阿克曼氏粘蛋白降解菌在腸中誘導抗原特異性T細胞應答，其主要表現為PP中的TFH細胞。
最後，文章回到特定的無病原體（SPF）小鼠，其中阿克曼氏粘蛋白降解菌 IgG1應答的更大變異性，並且在常規微生物群的背景下表徵了對阿克曼氏粘蛋白降解菌的T細胞應答。與我們對ASF系統的研究結果相似，轉移的Amuc124 T細胞擴增並定位於阿克曼氏粘蛋白降解菌陽性小鼠的PPs，但在阿克曼氏粘蛋白降解菌陰性小鼠中檢測不到（圖4，A和B，以及圖S8A）。PP中的大多數轉移的T細胞也採用TFH細胞標記物（圖4C和圖S8B）。因此，阿克曼氏粘蛋白降解菌還在複雜的微生物群的背景下誘導TFH細胞應答。然而，與ASF + Akk系統不同，在阿克曼氏粘蛋白降解菌陽性小鼠的腸道LP中檢測到更多數量的轉移T細胞（圖4B），其中一些採用與促炎性T細胞命運一致的標記物（圖4，D和E，以及圖S8，C到E）。儘管存在阿克曼氏粘蛋白降解菌，一些SPF Akk +小鼠組在轉移後檢測不到T細胞活化和增殖。因此，對阿克曼氏粘蛋白降解菌的T細胞應答似乎是背景依賴性的，導致在某些條件下除TFH細胞外還誘導其他CD4T效應。有趣的是，與已經描述的分段絲狀細菌（SFB）和幽門螺桿菌相比，SPF小鼠中對阿克曼氏粘蛋白降解菌的T細胞應答在不同的CD4 T細胞之間混合（圖S8E）。
圖4 阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性T細胞在複雜微生物群的背景下也採用其他生存方式
討論
先前認為共生特異性TD抗體僅限於對一小部分共生物種特異的IgA反應。本文工作表明，這種TD抗體還包括IgG1，它識別一小部分共生體，包括阿克曼氏粘蛋白降解菌。這些細菌可能具有某些特徵，例如接近腸上皮，這可能增加它們在屏障破壞期間引起疾病的可能性。事實上，據報道，對共生細菌具有特異性的系統性抗體可以預防腸道來源的敗血症，並且阿克曼氏粘蛋白降解菌可以在某些免疫缺陷環境中促進疾病的發生。
迄今為止，已經鑑定出很少的共生抗原，其在體內平衡期間導致腸中的抗原特異性T細胞應答。SFB和幽門螺桿菌屬兩者都引起非常明顯的反應。SFB在常規和單核化小鼠中均誘導RORgt + TH17細胞，而螺桿菌屬在LILP中誘導RORgt +FOXP3 + iTreg細胞。TFH細胞構成SFB-和幽門螺桿菌特異性T細胞的一小部分，但這些細胞分別處於TH17細胞或Treg主導的反應中。已經提出腸中的TFH細胞與TH17細胞或Tregs分化。相比之下，ASF + Akk系統產生共感特異性T細胞應答，其主要是TFH細胞的誘導，具有非常少的Treg，TH1，TH2或TH17細胞。因此，共生體特異性TFH反應可以發生在沒有不同的原發性CD4 T細胞反應的情況下，並可能與腸繫膜淋巴結或PPs中未分化的共生體特異性T細胞區分開來。因此，阿克曼氏粘蛋白降解菌似乎以不同於先前描述的T細胞活化共生細菌的方式參與粘膜免疫系統。這種共生特異性TFH反應與強大的抗血清TD IgG1和IgA一起出現。
令人驚訝的是，在常規微生物群的背景下，除了誘導TFH細胞外，阿克曼氏粘蛋白降解菌還可以誘導LP所在的其他的CD4 T細胞。總之，這些結果支持這樣的假設：T細胞對共生體的反應可能是背景依賴性的，不僅在急性胃腸道感染或炎症的情況下，而且存在於體內平衡期間。與某些微生物的相互作用可能改變阿克曼氏粘蛋白降解菌的定位或功能，或者由其他微生物提供的信號可能形成針對該共生細菌的免疫應答。
先前的工作已經確定阿克曼氏粘蛋白降解菌介導對宿主代謝的影響，並且可以影響基於抗PD-1的免疫療法對抗癌症的功效。這些作用的機制仍然知之甚少，但兩者似乎都是免疫介導的並且與1型免疫相關。特別是，人體對抗PD-1的免疫治療的反應與體外與阿克曼氏粘蛋白降解菌抗原孵育的外周T細胞的干擾素γ產生相關。有趣的是，並非所有患者都產生針對阿克曼氏粘蛋白降解菌的1型反應。文章結果為這種不同的反應提供了可能的解釋，並表明由於微生物群組成或其他環境信號的差異，個體中阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性T細胞反應的差異偏斜可能具有深遠的系統效應。確定這些共生特異性T細胞應答可能偏向不同的機制是一個具有明確臨床意義的重要目標。
結論
腸適應性免疫反應影響宿主健康，但是已經鑑定出僅在體內穩態期間誘導同源適應性免疫應答的少數腸細菌物種。在這裡，我們顯示阿克曼氏粘蛋白降解菌，一種與宿主代謝和PD-1檢查點免疫療法的全身影響相關的腸道細菌，在小鼠中誘導免疫球蛋白G1（IgG1）抗體和抗原特異性T細胞應答。與先前表徵的粘膜反應不同，T細胞對阿克曼氏粘蛋白降解菌的反應限於在生殖環境中的T濾泡輔助細胞，沒有明顯誘導其他T輔助命運或遷移到固有層。然而，阿克曼氏粘蛋白降解菌特異性反應是依賴於背景的並且在常規小鼠中採用其他命運。這些發現表明，在體內平衡期間，背景信號影響T細胞對微生物群的反應並調節宿主免疫功能。
結論
腸道適應性免疫反應宿主的健康狀況，而且適應性免疫細胞是腸道組織穩態的關鍵因素。因此，本文以阿克曼氏粘蛋白降解菌，這種存在於腸道的細菌為中心，展開了對該菌是否會引起腸道免疫球蛋白的應答的研究，結果發現在阿克曼氏粘蛋白降解菌存在的情況下會檢測到腸道T細胞的免疫應答，而且發生在體內穩態期，研究結果明確了一個重要的臨床針對應答偏向不用途徑的共生特異性T細胞的機制，臨床生具有重要意義。
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