作者：趙瑾 範俊麗 熊夢園 楊桂 潘運寶 李一榮
【摘要】目的：探討膠體金免疫層析法檢測血清中新型冠狀病毒（SARS-COV-2）特異性抗體的可行性。方法：採用膠體金免疫層析法檢測212個血清樣本中的SARS-COV-2特異性抗體，並計算檢測的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值和準確率。結果：新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）確診組、康復組與健康獻血組中SARS-COV-2特異性抗體的陽性率分別63.63%、87.80%和1.20%，康復組的陽性率顯著高於確診組（X2=7.98，p =0.005）；該方法檢測的靈敏度為71.31%，特異性為98.80%，陽性預測值為98.92%，陰性預測值為68.91%，準確率82.07%；根據發病時長將確診組樣本分為＜8天組、8~15天組和＞15天組，＜8天組的陽性率顯著低於8~15天組和＞15天組（X2=8.77，p =0.003；X2=7.66，p =0.006）；9個首次檢測為陰性的患者，在2-9天后再次採血檢測結果呈陽性。結論：膠體金免疫層析法是一種快速有效的檢測血清中SARS-COV-2特異性抗體的方法，但陰性結果一定要結合患者的發病時長綜合分析。
關鍵詞：新型冠狀病毒；新型冠狀病毒肺炎；抗體；膠體金免疫層析
2019年底，一種新型冠狀病毒（The severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARS-COV-2）首次在武漢出現，隨後快速播散到全中國乃至全世界，具有較強的傳染性與傳播能力【1】。SARS-COV-2引起新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease ，COVID-19），患者主要臨床表現為中低熱、乾咳和乏力，少數患者可出現流涕、鼻塞、咽痛、肌痛與腹瀉等【2】。患者早期胸部CT顯示肺部出現多發小斑片影及間質改變，可進展為雙肺多發磨玻璃影、浸潤影及肺實變【3】。病原學診斷主要依據SARS-COV-2核酸檢測，但不論是檢測咽拭子、鼻咽拭子、血液、痰以及大便與尿液中的SARS-COV-2核酸，其陽性率均不盡如人意，因此迫切需要新的檢測方法輔助COVID-19的診斷【4-6】。本研究擬採用膠體金免疫層析方法檢測血清中SARS-COV-2特異性抗體，用於評價其對COVID-19的診斷價值。
一、材料與方法
1.病例: 71例COVID-19確診患者為武漢大學中南醫院住院患者，滿足COVID-19第七版的確診病例的要求，其中男性36例，女性35例，年齡中位數56歲，年齡跨度20-96歲，其中55個患者檢測1次SARS-COV-2，15個患者檢測2次，1個患者檢測3次，共採集了88例血液樣本。41例COVID-19康復出院者， SARS-COV-2核酸檢測陰性，其中男性18例，女性23例，年齡中位數51歲，年齡跨度29歲-93歲。每個患者採集靜脈血5ml，置於紅色試管中，室溫放置2小時，3400rpm離心10min，吸取血清置於滅菌的EP管中，於-20℃保存。83例健康獻血者的血清來自中部戰區總醫院輸血科，血液樣本採集日期在2019年12月31前，血清樣本於-20℃保存。
2.檢測方法:(1)檢測試劑與原理：SARS-COV-2特異性抗體檢測試劑盒由廣州萬孚生物技術有限公司惠贈。該試劑盒採用膠體金免疫層析法檢測SARS-COV-2特異性抗體。當患者血清中含有SARS-COV-2特異性抗體時，則抗體與金顆粒標記的抗原結合，形成SARS-COV-2特異性抗體-金顆粒標記的抗原複合物，複合物通過層析效應擴散到檢測區，檢測區包被的第二抗體就會與SARS-COV-2特異性抗體-金顆粒標記的抗原複合物結合，形成第二抗體-SARS-COV-2特異性抗體-金顆粒標記的抗原複合物，從而在檢測區顯色。(2)檢測步驟：將-20℃保存的血清室溫解凍後，取10μl血清加入測試卡的加樣孔中，隨後向測試卡的稀釋液加樣孔加入80μl的樣本稀釋液，15分鐘觀察結果。當質控區與測試區均出現一條紅色反應線時，表示SARS-COV-2特異性抗體陽性，而僅質控區出現一條紅色反應線時，則表示SARS-COV-2特異性抗體陰性。
二、結果
1.膠體金免疫層析法檢測血清中SARS-COV-2特異性抗體：採用膠體金免疫層析法對212個血清樣本進行檢測，COVID-19確診組、康復組與健康獻血組的SARS-COV-2特異性抗體陽性樣本數分別為56（63.63%），36(87.80%)和1個（1.20%）。卡方檢驗顯示COVID-19康復組中SARS-COV-2特異性抗體的陽性率顯著高於確診組（X2=7.98，p=0.005）。將COVID-19確診與康復患者合併後，則該方法檢測的靈敏度為71.31%，特異性為98.80%，陽性預測值為98.92%，陰性預測值為68,91%，準確度82.07%。
2.發病時長對血清SARS-COV-2特異性抗體檢測結果的影響：將88個來自COVID-19確診患者的血清按照發病時長（發病到採樣之間的時長）分為<8天組，8~15天組和＞15天組，每組的陽性數及陽性率具體見表1。卡方檢驗顯示三組的陽性率存在顯著性差異（X2=12.08，p=0.002），<8天組的陽性率顯著低於8~15天組和＞15天組（X2=8.77，p=0.003；X2=7.66，p=0.006 ），但8~15天組和＞15天組的陽性率無顯著性差異（X2=0.005，p=0.94）。
3.同一病人血清SARS-COV-2特異性抗體監測結果：共有16個病人在不同發病時期採集了2次或3次血液進行了SARS-COV-2特異性抗體的檢測，其中7個患者前後兩次結果均為陽性，而另外9個病人首次檢測均為陰性，而後第2或第3次檢測結果均變為陽性，具體結果見表2
三、討論
SARS-COV-2為一種β類的新型冠狀病毒，可通過呼吸道和消化道進行傳播。其引起的COVID-19為乙類傳染病，危害極大，因此早期快速診斷對於COVID-19的防控具有重要價值【1-3】。採用實時熒光RT-PCR法檢測咽拭子等樣本中SARS-COV-2的RNA是明確COVID-19病因的重要方法，但是該方法必須在標準化的PCR實驗室中進行，而且病毒滅活如不充分可能會導致實驗室播散並感染檢測者【4-6】。另外由於採樣等因素該方法具有一定的假陰性率，因此迫切需要建立新的方法用於COVID-19的病原學檢測。
膠體金免疫層析技術是一種快速檢測抗原或抗體的方法。該方法操作簡單、結果容易判讀，而且不需要特殊的儀器與設備，因此我們採用廣州萬孚生物技術有限公司生產的膠體金免疫層析試劑盒，分別對COVID-19的確診者、康復者以及健康獻血者血液中的SARS-COV-2特異性抗體進行檢測。本研究之所以選擇2019年12月31號前採集的獻血員標本進行特異性實驗，是因為擔心疫情下的武漢，除了顯性感染外，可能還有一定比例的隱性感染患者。研究結果顯示COVID-19的確診組、康復組和健康獻血者組中血請SARS-COV-2特異性抗體的陽性率分別63.63%、87.80%和1.20%，將確診組和康復組合併為研究組，則該方法檢測的靈敏度71.31%，特異性為98.80%，陽性預測值為98.92%，陰性預測值為68,91%，準確度82.07%，提示採用膠體金免疫層析法檢測血清中的SARS-COV-2特異性抗體具有較高的準確性與陽性預測值，但陰性結果的分析與判斷應慎重。
為了明確陰性預測值偏低的原因，我們首先比較了COVID-19康復組與確診組血清的SARS-COV-2特異性抗體的陽性率，結果顯示康復組血清SARS-COV-2特異性抗體的陽性率顯著高於確診組，提示發病時長可能影響SARS-COV-2特異性抗體的檢出率。隨後我們將確診組的樣本按發病時長分為3組，即<8天組、8~15天組和＞15天組，結果顯示8~15天組和＞15天組的陽性率均高於<8天組，進一步支持發病時長影響SARS-COV-2特異性抗體的檢出率。我們還對16例COVID-19確診患者血清的SARS-COV-2特異性抗體的檢測結果進行了前後比較，9例首次陰性的患者在2-9天再次採血其SARS-COV-2特異性抗體呈現陽性。因此發病時間過短採血檢測SARS-COV-2特異性抗體是導致膠體金免疫層析法陰性預測值偏低的重要原因。支持我們的觀點，眾多免疫學檢測方法均存在窗口期，如採用ELISA或化學發光法檢測SARS-COV特異性抗體，其窗口期多達8天，採用化學發光法檢測抗HIV抗體，其窗口期更是多達11天【7-10】。
總之，膠體金免疫層析法是一種快速有效的檢測血清中SARS-COV-2特異性抗體的方法，具有較高的準確性與陽性預測值，但陰性結果一定要結合患者的發病時長綜合分析，發病早期採血檢測SARS-COV-2特異性抗體容易出現陰性結果。
參考文獻略
注：本文來源於《臨床實驗室》2020年第3期“新冠病毒實驗室診斷”專刊
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