由病毒或細菌引起的呼吸道病毒感染是全球人類最常見的疾病之一，而由新興病毒引起的疾病則是造成新型感染的疾病，
例如最近導致中國武漢爆發肺炎的新型冠狀病毒2019-nCoV，對全球公共衛生的產生巨大威脅。識別呼吸道病毒感染的致病性病原對於選擇適當的治療方法，挽救人們的生命，停止流行病以及避免不必要地使用抗生素很重要。常規診斷測試，例如用於快速檢測抗病毒抗體或病毒抗原的測定法，已在許多臨床實驗室中廣泛使用。隨著現代技術的發展，包括多重核酸擴增和基於微陣列的測定在內的新的診斷策略正在出現。2020年1月15日，復旦大學姜世勃等人在Journal of Medical Virology 在線發表題為“Recent advances in the detection of respiratory virus infection in humans”的綜述文章，該綜述總結了用於檢測常見呼吸道病毒【例如流感病毒，人呼吸道合胞病毒（RSV），冠狀病毒，人腺病毒（hAdV）和人鼻病毒（hRV）】的當前可用和新穎的診斷方法。還描述了用於同時檢測多種呼吸道病毒的多重測定。預計這些數據將有助於研究人員和臨床醫生制定適當的診斷策略，以便及時有效地檢測呼吸道病毒感染。
1.介紹
急性呼吸道疾病（ARD）在全世界所有急性發病率和死亡率中佔很大比例，其中急性病毒性呼吸道感染是主要原因（約80％）。主要病毒病原體包括流感病毒，呼吸道疾病合胞病毒（RSV），冠狀病毒，腺病毒和鼻病毒。在5歲以下的兒童中，僅流感和RSV的全球總死亡率每年就達到300,000例死亡。其他呼吸道病毒（如腺病毒和鼻病毒）的死亡率較低，但發病率很高，造成了巨大的經濟負擔。 可能引起流行病或大流行的高致病性新興和複發性冠狀病毒，例如嚴重的急性呼吸綜合徵冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸綜合徵冠狀病毒（MERS-CoV），已對全球公共衛生構成了巨大威脅。最近，一種新穎的冠狀病毒2019-nCoV（https://www.who.int）導致嚴重的公共衛生事件。該冠狀病毒的完整基因組序列已於2020年1月10日發佈，與SARS-CoV和蝙蝠型SARS冠狀病毒（SL-CoV）超過82％序列相似性。
對致病性病毒病原進行準確，快速的診斷對於選擇適當的治療方法，挽救人們的生命，制止流行病並減少不必要的抗生素使用非常重要。上述所有病毒均可引起上呼吸道感染和下呼吸道感染，以及重疊的臨床表現，如果沒有紮實的實驗室分析，醫生很難區分病原體。常規的診斷方法，例如病毒培養和直接/間接免疫熒光測定（IFA），既費時又費力，而且靈敏度有限。
快速，準確地診斷呼吸道病毒可以幫助進行流行病學監測，以及採取有效的預防措施和實施適當的抗病毒治療。在過去的幾十年中，從常規方法到快速抗原檢測，病毒診斷測試一直在發展。最近，已經開發出高靈敏度的核酸擴增試驗（NAAT）和即時檢驗（POCT）。在這篇綜述中，研究人員描述了目前可用於診斷人類呼吸道病毒感染的各種方法。 預計這些數據將有助於臨床實驗室快速準確地診斷呼吸道病毒，從而為醫生提供及時和適當治療患者的基本信息。該綜述總結了常用的流感病毒，RSV，冠狀病毒，腺病毒和鼻病毒的診斷方法，並在下面的評論中進行了詳細描述。
2.流感病毒及其診斷方法
流感病毒屬於正粘病毒科。 該家族由五個屬（甲型流感病毒，乙型流感病毒，丙型流感病毒，Thogotovirus和Isavirus）組成，它們根據內部核蛋白（NP）和基質（M）蛋白進行分類。 在這些屬中，僅甲型和乙型流感病毒引起臨床疾病。 乙型流感病毒感染通常引起局部性暴發，而甲型流感病毒是人類感染的主要病原體，因此是大流行性流感的主要原因。基於糖蛋白血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）， 甲型流感病毒位於病毒表面，分為多種亞型。 到目前為止，已鑑定出18種HA（H1-H18）和11種NA（N1-N11）亞型。已使用許多診斷方法，包括病毒分離以及一些新興的基於分子的方法來檢測發生流感的病毒種類。
3.人類呼吸道合胞病毒及其診斷方法
人RSV是副粘病毒科的無節段，負義和單鏈RNA病毒。RSV的基因組包括十個編碼11種蛋白質的基因。根據基因組序列和單克隆抗體（mAb）對錶面糖蛋白（G）和融合蛋白（F）的反應性，RSV可以分為A和B組。RSV是導致嚴重呼吸道疾病的主要原因。免疫功能低下的人群，例如嬰兒和老年人群，在全球範圍內具有很高的發病率和死亡率。早期和準確的RSV診斷對於適當的治療至關重要。
4.冠狀病毒及其診斷方法
冠狀病毒屬於冠狀病毒科。蝙蝠已被公認是各種冠狀病毒的天然宿主和載體，並且該病毒已經越過物種壁壘感染人類和許多其他種類的動物，包括鳥類，齧齒動物等。冠狀病毒可能引起呼吸系統疾病和神經系統疾病。到目前為止，已鑑定出六種人類冠狀病毒（HCoV），包括HCoV-229E，HCoV-HKU1，HCoV-OC43，HCoV-NL63，嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸綜合症冠狀病毒（ MERS-CoV）【注：新型冠狀病毒2019-nCoV沒有統計在內】。
MERS-CoV是一種人類冠狀病毒，於2012年6月首次報道，可引起人類呼吸系統疾病，它被歸類為Cβ-冠狀病毒譜系，其結構包含約30 kb的正向鏈，人類MERS-CoV與MERS-CoV來源於駱駝具有超過99.5％的核苷酸同一性，這表明人和駱駝分離物屬於同一冠狀病毒物種。截至2019年9月30日，實驗室確認的2468例MERS-CoV感染病例，包括851例死亡。由於目前尚無用於MERS的商業疫苗或治療方法，因此快速準確地診斷MERS-CoV對於預防其傳播和暴發非常重要。
當前對冠狀病毒的診斷測試包括RT-PCR，實時逆轉錄PCR（rRT-PCR），逆轉錄環介導的等溫擴增（RT-LAMP）以及實時RT-LAMP。
基於靶向SARS-CoV和MERS-CoV保守的S2基因的引物和探針，開發了一種RT-PCR方法。通過使用pUC57SARS-pS2作為SARS-CoV的模板和pGEM-MERSS2作為MERS-CoV的模板，可以實現50-100拷貝/ mL的足夠檢出限。設計了單重RT-iiPCR檢測MERS-CoV包膜基因（upE）和開放閱讀框1a（ORF1a）基因分開。與參考單重RT-qPCR檢測相比，單重MERS-CoV ORF1a和upE RT-iiPCR檢測的靈敏度分別為99.03％和100％。
有六種基於rRT-PCR的市售MERS-CoV RNA檢測試劑盒，包括AccuPower（韓國Bioneer），Anyplex（韓國Seegene），DiaPlexQ（韓國Solgenent），LightMix（瑞士羅氏分子診斷公司），UltraFast試劑盒（韓國Nanobiosys）和PowerChek（韓國Kogene Biotech）。 因此，上述六種rRT-PCR試劑盒的整體靈敏度和特異性足以診斷MERS-CoV感染。
在RT-LAMP分析中，構建了兩套引物，其中一套針對N基因，一套針對ORF1a基因。兩組都顯示了高效擴增來自不同MERS-CoV株的靶序列的效果，並且與其他呼吸道病毒沒有交叉反應。Huang的研究小組已經建立了一種將RT-LAMP技術和垂直流相結合的核酸可視化技術。可視化條（RT-LAMP-VF）檢測MERS-CoV的N基因。RT-LAMP-VF檢測方法與多個SARS相關CoV（包括HKU1，HKU4，OC43和229E）無交叉反應的RNA，因此具有很高的特異性。
上面提到的RT-LAMP和RT-LAMP-VF是用於快速準確檢測MERS-CoV感染的檢測方法。 Bonhan Kooa的團隊設計了一種拱形多目標傳感器，該傳感器能夠通過在臨床樣品中直接擴增來快速鑑定病原體。該方法能夠以高靈敏度和特異性檢測包括MERS-CoV在內的多種病毒，並且能夠在20分鐘內將臨床樣品中的MERS-CoV與HCoV區分出來。
5.人腺病毒及其診斷方法
腺病毒（AdV）感染現在被視為人類或動物發病率和死亡率的重要來源。人腺病毒（hAdV）感染很容易傳播，可感染所有年齡段的人群，尤其是嬰兒和老年人，以及具有免疫缺陷和器官移植的人群。HAdV具有直徑70至100nm的無包膜球形結構。外殼由252個帽殼組成，包括240個六鄰體和12個Penton，由二十面體病毒衣殼組成。帽體排列在20個三角形表面上，使殼形成30個邊和12個頂點。hAdV的基因組以線性雙鏈DNA的形式存在於衣殼中，大小從34到37 kb以上不等。HAdV屬於腺病毒科，已經被分類。根據六鄰體和纖維蛋白特性，相對核酸同源性，免疫化學反應，生物學特性和系統發育關係分為7種（A至G），具有50種以上血清型。該細分具有一定的臨床意義，主要是因為不同的hAdV在組織方向和疾病類型上有所不同。HAdV可引起多種疾病，例如呼吸系統疾病（hAdV-B，-C和-E），腸胃炎（hAdV-F和-G），角膜結膜炎（hAdV-B和-D）和腦膜腦炎（hAdV-A， -B和-D）。因此，在hAdV進展之前對其進行有效，快速的診斷將提供對hAdV感染的有效監測，並確保及時有效地治療與hAdV相關的疾病。
6.鼻病毒及其診斷方法
鼻病毒（RVs）是屬於Picornaviridae腸病毒科的RNA病毒，已被分類為3種（A至C），具有超過160種血清型。RVs是具有二十面體對稱的小型單鏈RNA病毒。RVs是兒童和成人中最常見的呼吸道感染原因。RV-A和RV-C是常見的RV種類，可引起下呼吸道疾病，喘息和急性哮喘，與兒童相比，它們可能導致比RV-B更嚴重的症狀。
病毒的培養分離和酸穩定試驗相結合是RV診斷的經典方法。但是，該測定費時且費力，從而限制了其在臨床治療中的價值。可以通過免疫學方法檢測人RV抗體。但是，由於缺乏合適的交叉反應抗原來覆蓋大量RV血清型，這些方法的應用受到很大限制。相比之下，一步式實時PCR分析通過使用序列檢測RV。該測定法改善了工作流程，減少了準備時間，並消除了從逆轉錄反應步驟中cDNA可能引入的交叉汙染。半嵌套式RT-PCR測定法基於一種極其靈敏的PCR方法，可檢測空氣傳播的RVs的檢出限（LOD）約為0.8。隨著全基因組測序（WGS）技術的迅速發展，越來越多的實驗室可能在臨床上對人RV分離株進行WGS 。隨著hRV-C的發現，全基因組hRV測序的數據量已大大增加和改善。
這將有助於研究人員和臨床醫生了解RV的進化和重組，可以改善診斷。7.多重呼吸道病毒檢測
儘管可以在有症狀的患者中檢測到單個呼吸道病毒，但其他呼吸道病毒也可能同時存在。兒童，尤其是五歲以下的兒童，發生共感染的頻率更高。在單個試管中包含多個病毒基因靶標的多重測定法具有快速檢測幾種潛在病毒病原體的優勢。同時。多重實時PCR已允許在短時間內同時檢測多種呼吸道病毒。與單重方法相比，多重診斷方法具有更高的樣品通量（每次運行96個樣品），更短的週轉時間（5h）和更少的樣品需求量。
8.結論
在全世界所有年齡組中，呼吸道病毒都是症狀性呼吸道感染的主要原因。對這些病毒的及時，準確的診斷可以對感染進行適當的治療。總結了幾種常見的呼吸道病毒（如流感病毒，人RSV，冠狀病毒，hAdV和鼻病毒）的傳統和現代分子診斷方法，以及它們的優點，缺點和原理。但是，這些呼吸道病毒容易因病毒基因中的點突變而引起抗原漂移，基因重排可能導致具有大流行潛力的新菌株。所有這些繼續對快速準確地檢測人類呼吸道病毒感染提出了新的挑戰。
因此，鑑定病毒基因組內的突變是非常必要的。但是，為查明人類呼吸道病毒的基因突變所做的努力依賴於使用Sanger測序對單個基因或基因家族進行高通量測序。儘管這種方法取得了豐碩的成果，但Sanger測序的成本和通量通常禁止構成外顯子組的〜22,000個基因的系統測序。 NGS技術的最新發展通過提供以相對較低的成本快速測序外顯子組，轉錄組和基因組的能力，改變了這種範例。 NGS在呼吸道病原體的診斷和鑑定中的應用，特別是對於重症肺炎或不明原因感染的患者，越來越受歡迎。與傳統方法相比，NGS具有檢測重症肺炎患者中合併感染的能力，並且在診斷重症肺炎中表現良好。作為一種不經常循環的基因型，病毒株整個基因組的表徵將促進對其流行病學和致病性的進一步研究，並有助於診斷新出現的呼吸道病毒。 WGS可以更好地識別傳播事件和爆發，這在亞基因組序列中並不總是可能的。
參考消息：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/jmv.25674
閱讀更多 愛科學愛自然 的文章
