免疫化學發光並非萬能，單分子免疫檢測未來可期（下篇）

化學發光技術已經成為當前免疫診斷市場中最重要的檢測技術。自上世紀70年代誕生以來，儘管隨著檢測設備全自動化水平以及檢測元件精密度、試劑生產保存工藝的發展，化學發光技術的檢測靈敏度有了顯著的提升，然而究其本質而言，無論是酶促發光、直接發光或是電化學發光，化學發光技術在檢測原理上在過去的近50年裡並沒有得到任何改變。可以認為在自動化水平已經達到相當高程度的今天，化學發光技術在現有抗體親和力水平的前提下，已經接近了其檢測能力的極限。

免疫診斷市場在新型標誌物或新型診斷市場上的開拓，可能需要一種從檢測原理層面進行變革的新型免疫診斷技術——單分子免疫檢測。

本文將分為以下幾個部分探討下一代免疫診斷技術——單分子免疫檢測對現有免疫診斷市場的影響以及在體外診斷市場普及應用的可行性。

上篇我們介紹了以下內容:

（1） 化學發光發展現狀

（2） 單分子檢測技術——生物檢測技術的極限標尺

（3） 從化學發光到單分子免疫檢測有多遠

（4） 數字PCR技術的發展給單分子免疫檢測的啟示

下篇聊聊以下部分：

（5） 單分子免疫檢測技術發展現狀

（6） 單分子免疫檢測平臺技術分析

（7） 單分子檢測技術是分子檢測與免疫檢測平臺統一化的可行橋樑

（8） 超低成本單分子免疫檢測技術實現的可能性

5. 分子免疫檢測技術發展現狀

單分子免疫檢測是指通過免疫標記的方法，利用抗體捕獲和識別抗原，進行信號分子標記或是酶聯標記的形式，通過單分子熒光信號檢測或單分子酶促反應實現的單分子級別蛋白分子的檢測，其檢測靈敏度遠超現有的化學發光技術平臺。

目前全球範圍內，已商品化的單分子級別免疫檢測的技術平臺僅有Quanterix公司的SiMoA系統和Merck的SMC系統。

美國Quanterix公司的創始人是David Walt，他是美國塔夫茨大學化學系的教授，不僅是美國國家科學院和工程院的雙料院士，還是基因測序龍頭企業Illumina公司的創始人。

2007年，David Walt在美國馬薩諸塞州創立了公司QuanterixCorporation，首次推出SiMoA技術。

2013年該公司上市了科研系列產品——基於SiMoA技術的檢測設備。

2015年推出第二代基於SiMoA技術的檢測設備，並於該年取得1000多萬美元銷售額。

2017年，公司實現超過2000萬美元的銷售收入。

SiMoA（Single Molecule Array）系統源自於DavidWalt與David Duffy的團隊開發的一套“DigitalELISA”檢測系統。其檢測原理與數字PCR近似，都是通過微反應器單元進行單分子隔離結合單分子水平信號放大來實現的。

SiMoA系統通過免疫反應將磁珠捕獲的抗原分子使用半乳糖苷酶標記，再將其分散到微米尺度的微孔陣列中，通過使用油相進行物理上的隔絕，讓微孔中單分子半乳糖苷酶進行酶促反應，產生熒光信號。其檢測端與數字PCR相同，使用“0”與“1”對根據微孔熒光強度進行標記，通過“1”和“0”的計數和佔比分析實現單分子計數以及超高靈敏度的蛋白檢測分析。

表2 Quanterix Corp融資歷史

由於SiMoA技術遠遠領先於現有的各類免疫診斷技術，其單分子水平的檢測能力更是被認為“將改變整個蛋白標誌物檢測市場遊戲規則”，因而深受資本市場的認可。

Quanterix公司的融資歷史如表2所示，公司於D輪獲得了5450萬美元的融資，其中包括了國內企業樂普醫療通過樂普-民和全球精準醫療創新投資基金增資的1100萬美元，用於公司IVD產品的開發註冊與推廣。公司於2017年末在納斯達克上市。

SiMoA系統的出現，徹底打破了免疫診斷市場中，現有的檢測技術在檢測能力或檢測靈敏度水平的極限，使得單分子蛋白檢測成為了可能。受限於SiMoA複雜的操作流程以及難以控制的高昂試劑耗材製造成本，儘管Quanterix公司2016、2017年已實現1758.50萬美元、2287.40萬美元的營業收入，其虧損額度卻高達2317.3萬美元和2701.9萬美元。

但是，這依然不能阻礙SiMoA系統所代表的單分子免疫檢測技術成為近幾年海外在免疫檢測技術當中最趨之若鶩的方向。

繼SiMoA系統之後，Merck公司主推的SMC（SingleMolecule Counting）系統最早由Singulex公司開發，於2015年由MerckLife Technology收購其生命科學領域的使用權。Erenna系統是SMC第一代單分子檢測設備，該設備通過流式分子掃描檢測的方法，實現分子計數功能。

由於受限於Erenna設備的製造成本和穩定性問題，2018年初，Merck公司推出了第二代單分子免疫檢測設備SMCxPRO。SMCxPRO於2018年5月前後在國內市場開始推廣，國內單臺設備售價超過20萬美元，96人份·的試劑盒市場售價均超過2000美元，研發用試劑盒更是高達6000美元（30test）。截至目前為止，該設備國內銷量已超過6臺。

與SiMoA技術使用的單分子酶催化信號放大策略不同，SMC技術採用更為直接的設備依賴型單分子檢測方法。SMC系統中，將激光聚焦到光學極限尺度範圍內，使得微米尺度的聚焦光斑範圍內的激發光源能量達到一個極高程度。在這個光斑中，通過免疫反應標記的單個或數個熒光染料分子將釋放出足夠多的光子以確保被PMT檢測到，實現單個分子的計數功能。

繼SiMoA系統之後，SMC系統再次讓單分子免疫檢測技術進入相關領域的視野，進一步引發業內人員對下一代免疫診斷技術的思考。

6. 單分子免疫檢測平臺技術分析

6.1 SiMoA系統

圖3 SiMoA操作流程示意圖

圖4 SiMoA HD-1 Analyzer設備圖

SiMoA通過磁珠酶聯免疫反應與微孔陣列芯片的結合，實現單分子蛋白檢測。其操作流程如下：

（1）利用表面標記有捕獲抗體的磁珠捕獲樣品中的抗原；

（2）使用biotin標記的檢測抗體對被捕獲的抗原進行標記；

（3）加入鏈黴親和素——半乳糖苷酶複合物，與檢測抗體上的biotin結合；

（4）將反應洗淨後的磁珠與底物混合，加載到含有微孔陣列的檢測芯片中，利用磁場使磁珠落入與其尺寸完全匹配的微孔中（3μm左右），加入油相，使得微孔之間物理隔離；

（5）含有半乳糖苷酶的微孔由於酶分子催化底物產生熒光產物；

（6）對微孔陣列進行熒光成像，通過對發出熒光信號的微孔個數對照標準曲線來實現定量檢測。

SiMoA系統實際上沿用了數字PCR中的單分子信號放大的方法，通過酶聯免疫進行抗原分子酶聯標記，再通過酶催化熒光底物的方法替代數字PCR技術中PCR來實現信號放大。根據目前Quanterix官方公佈的數據，SiMoA系統是當前全球範圍內檢測靈敏度最高的免疫檢測系統，

然而，SiMoA系統存在很明顯的一些缺點：

（1）檢測操作流程過於繁瑣複雜。

一方面使得檢測設備的複雜程度增加，體積龐大，造價和維護費用高昂。另一方面增加了檢測過程中，各個步驟不確定性疊加帶來的嚴重的穩定性問題，尤其是檢測體系中使用的半乳糖苷酶與FDG熒光底物都存在明顯的穩定性問題。

（2）SiMoA系統使用的盤式微流控芯片加工精度高，生產成本高昂。

由於半乳糖苷酶催化效率遠比酶聯免疫中常用的HRP酶催化效率低，為了確保生成的熒光產物能集中濃縮到足夠大的濃度，理論上必須儘可能縮小微單元的尺寸。根據筆者個人研發經驗，當液滴尺寸大於10 μm後，半乳糖苷酶在其分子壽命內催化產生的熒光信號將難以和背景信號有效區分。

SiMoA系統使用了接近微米加工體系極限的3 μm微孔陣列以確保半乳糖苷酶催化產生的熒光信號能夠準確識別，使得其芯片加工成本遠遠超過目前IVD市場所能接受的範圍。而另一方面，由於在磁珠與底物載入微孔，利用油相密封之前，磁珠與底物是預先混合的，為了儘可能降低背景信號，需要對磁珠載入微孔並密封的步驟進行嚴格的時間控制，這也進一步提高了對設備精密度的要求。

（3）SiMoA檢測系統單次檢測耗時長達1小時以上，遠超過目前免疫診斷市場中已經能輕易實現的15分鐘報告時間。

因而，綜合考慮檢測成本、檢測效率、檢測試劑穩定性、後期維護成本等一系列因素，SiMoA系統在推廣至臨床診斷市場時必將面臨明顯的阻礙。

6.2 SMC系統

圖5 SMC工作原理圖

圖6 SMC第一代檢測設備Erenna與第二代檢測設備SMCxPRO

SMC系統是設備依賴型的單分子檢測技術。與SiMoA通過降低反應單元體積，濃縮熒光產物的思路不同，SMC採取的是更為直接的通過激光聚焦的形式提高免疫標記的少數幾個熒光染料分子的光子產量，來實現單分子的計數檢測。

SMC進行單分子免疫檢測的步驟如下：

（1）利用標記有捕獲抗體的酶標板或磁珠捕獲抗原

（2）使用標記有數個熒光染料分子的檢測抗體對抗原進行熒光標記

（3）將抗原與熒光標記的檢測抗體使用專用洗脫液洗脫，轉移至檢測孔中

（4）使用設備進行單分子計數。

SMC系統第一代檢測設備是Erenna，是一種流動式的熒光分子掃描系統。進行熒光分子掃描時，需要使溶液中的洗脫下來的熒光分子逐個通過極小的檢測窗口。在檢測窗口中，利用激光聚焦技術將高功率激光聚焦到微米尺度，形成艾裡斑（Airydisc），一方面可以避免多個抗原標記的熒光分子出現信號疊加，另一方面可以在光學極限尺度下儘可能提高檢測窗口激發光源的能量，提高單一抗原標記的僅有的少數幾個熒光分子的光子產量，確保單分子信號與背景噪音區分開。

然而，這種檢測方法帶來了幾個問題：

（1）由於檢測窗口很小，幾十微升甚至上百微升體積的洗脫液要全部流過檢測窗口將花費大量時間（數十分鐘），且由於操作環境的干擾，檢測窗口的液體通道極易堵塞，需要使用專門過濾處理過的洗脫溶液。

（2）艾裡斑處於光學衍射的極限，這使得設備對光學系統的調校精準程度和設備操作環境的穩定性都有著極為嚴苛的要求。

為了解決該問題，Merck公司推出了第二代SMC設備SMCxPRO。第二代SMC系統兼容磁珠與多孔板的抗原捕獲方式，但是為了降低反應背景和避免磁珠透光度有限造成的光源或發射光遮擋的問題，依然必須進行熒光分子的洗脫，並使用專用檢測孔裝載檢測液檢測。SMCxPRO改變流動式掃描熒光分子的形式，改為通過旋轉光源，在檢測孔中對三維尺度的洗脫液進行掃描，從而顯著提高分子計數的效率。該檢測方法嚴格意義上已經脫離了單分子絕對計數的概念。由於溶液中的熒光分子存在布朗運動，分子運動軌跡不可預測，這使得檢測過程中存在分子重複計數或漏檢的可能性，一定程度上降低了檢測靈敏度，理論上需要算法輔助校正。

在單次完整檢測耗時上，二代SMC系統儘管已經在一代系統的基礎上進行了顯著改善，但是單次檢測依然需要超過4個小時。綜合來看，SMCxPRO依然只能用於科研級別檢測分析（事實上Merck公司對SMC技術的定位也僅限於科研領域），儘管該系統檢測靈敏度遠超目前主流的各大化學發光技術平臺，但其他方面的特性遠未達到醫療診斷產品的要求。

7. 單分子檢測技術是分子檢測與免疫檢測平臺統一化的可行橋樑

分子檢測與免疫檢測在檢測平臺上的統一是體外診斷領域業內人士一直在探討的問題。分子與免疫檢測在檢測平臺上的統一不僅可以顯著降低檢驗科室，特別是門診量大的三甲醫院檢驗科室的空間資源成本、人工成本、設備終端採購成本、維護成本以及試劑成本，更有可能從根本上杜絕核酸擴增過程中產生的氣溶膠汙染問題，並顯著降低分子診斷的耗時。

目前市場上的分子檢測產品實現高靈敏、高特異性檢測分析的基礎是核酸擴增方法指數級信號放大的方法和PCR引物的高特異性，而免疫檢測體系更多的則是依賴於抗體對抗原分子結合的高親和性與高特異性。

由於分子檢測與免疫檢測在方法學上的根本差異，使得二者之間有著難以逾越的鴻溝。

然而，對於單分子檢測技術而言，分子與免疫的檢測卻是有可能實現檢測技術平臺上的統一——以單分子級別的檢測技術，通過犧牲靈敏度的形式放棄核酸擴增步驟，使用更為簡單卻依然保持有良好特異性的分子雜交形式進行核酸分子的檢測。

這種檢測形式除了可以顯著降低分子診斷所需時間，輕易實現類似於RNA、mRNA等的單鏈片段核酸分子的檢測，更重要的是由於不需要核酸擴增，可以徹底解決目前分子診斷中最為麻煩的問題——氣溶膠汙染，從而顯著降低分子診斷實驗室的環境控制要求。SiMoA能同時進行高靈敏度蛋白與核酸檢測正是採用了這一策略。

實際上，使用現有的單分子免疫檢測技術平臺，通過分子雜交的方法，完全可以實現pM（與PCR近似靈敏度）以下甚至接近fM水平核酸分子的檢測。SMC系統由於可以在分子探針上直接標記熒光分子或熒光分子團簇，理論上也不存在核酸與免疫檢測平臺統一的技術壁壘。

相信隨著單分子水平檢測技術的發展，分子與免疫檢測在技術平臺上的統一將可以很快實現。

8. 單分子檢測技術發展瓶頸與發展趨勢

其實無論是數字PCR，或是單分子免疫檢測技術的SiMoA系統和SMC系統，對於現階段體外診斷市場，他們的發展瓶頸都集中體現在現存的體外診斷體系下，下一代診斷技術在過渡發展期的兩個核心問題：（1）成本；（2）替代的必要性。

而這兩個問題卻是最需要時間來消化。當我們回顧體外診斷技術發展的歷程，就會發現無論是化學發光技術或是實時熒光定量PCR技術，其誕生時間都並不比酶聯免疫或是傳統PCR晚多少。從化學發光技術對酶聯免疫技術的替代、實時熒光定量PCR技術對傳統PCR技術的替代，也都經歷過類似的過渡時期。而他們之所以能成為現在體外診斷市場核心技術，正是由於時間推動了技術的發展，解決了上述兩個核心限制性問題。

作為生物檢測技術的極限尺子，單分子檢測技術取代現有診斷技術成為市場的主流有可能是將來體外診斷市場發展的趨勢。

與傳統檢測技術相比，單分子檢測技術的核心意義並不體現在能對現有的體外診斷系統能提供多大程度的改善，而是體現在將來為體外診斷市場的縱向拓展提供了多大的可能性。所以筆者認為，對於單分子級別檢測技術的投資，實際上是對下一代檢測技術的投資，需要用更長遠的眼光去關注3年、5年乃至10年後生物體外診斷技術的發展趨勢，提前做出佈局。

9. 超低成本單分子免疫檢測技術實現的可能性探討

SiMoA系統和SMC系統代表了現有技術下，實現單分子免疫檢測的兩種技術策略，即以信號放大的形式來降低檢測設備靈敏度需求和以提高檢測設備靈敏度的形式來實現分子級別的計數。兩種策略中，前者的技術成本和風險集中於試劑，而後者則主要集中在檢測設備上。

針對現有的體外診斷市場特點，筆者認為前一策略短期內相對而言將具有更大的發展潛力和應用空間。SiMoA系統受限於操作體系的複雜程度和微流控芯片生產、控制的成本問題，暫時還難以真正盈利，大規模推廣向醫療市場。但是，如果能尋找到一種更為廉價，甚至可以以POCT產品能夠接受的成本實現信號放大與檢測，相信單分子免疫技術替代化學發光的一天將很快到來。

廈門宇測生物科技有限公司 官志超

官志超，廈門大學碩士。2009年師從楊朝勇教授正式進入實驗室，從事於微流控芯片、數字化PCR、單分子蛋白檢測、POCT新方法的研究。碩士期間以一作身份發表Angew.Chem. Int. Ed.（IF 12.1）兩篇，Anal.Chem.（IF 6.0）一篇，Biomicrofluidics（IF 2.6）一篇，二作身份發表AMI（IF 8.0）一篇。2014年因研發的新技術獲得投資，放棄ETH公派博士offer，投入創業，組建廈門佰盛特生物科技有限公司。作為公司副總經理負責新型POCT技術的研發、生產及醫療器械批文申報，具有豐富的研發、生產、管理和註冊經驗。18年因AstraSystem技術獲得突破，獨立組建團隊，成立廈門宇測生物科技有限公司。

廈門宇測生物科技是國內首家從事於單分子免疫診斷技術產業化的高科技型企業。公司目前已完成低成本、易操作的單分子免疫檢測技術的研發和轉化，將真正實現超低成本單分子免疫技術在醫療診斷市場的應用。

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關鍵字: 檢測 樂普醫療 化學發光