SB系統的開發，可直接穿透細胞，改善了對基因插入的控制

Sleeping Beauty（SB）轉座子系統是哺乳動物細胞中一種有效的非病毒基因轉移工具，但其廣泛使用受到

2019年11月4日，歐洲分子生物學實驗室Orsolya Barabas及德國維爾茨堡大學Michael Hudecek共同通訊在Nature Biotechnology 在線發表題為"A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion"的研究論文，該研究設計創建具有增強的溶解性和穩定性的SB轉座酶（高溶解度SB，hsSB）。該研究證明，hsSB可以與轉座子DNA一起傳遞，以遺傳修飾細胞系和胚胎，造血和誘導多能幹細胞（iPSCs），克服了不受控制的轉座酶活性。

研究人員使用hsSB生成嵌合抗原受體（CAR）T細胞，在體外和異種移植小鼠中均顯示出強大的抗腫瘤活性。有趣的是，該研究發現hsSB可自發穿透細胞，從而無需使用轉染試劑即可修飾iPSC和生成CAR T細胞。hsSB每個基因組僅進行兩次整合。總之，該技術由於其簡單性和多功能性，與目前的標準相比，將大大降低製造成本，並有助於增加基因和細胞療法的應用。

細胞和生物體中引入所需的轉基因已成為研究和生物技術的關鍵技術，離體工程改造的人類細胞的臨床應用證明了其在再生醫學和癌症治療中的治療潛力。例如，最近將重組基因的T細胞與含有CAR的遺傳信息一起使用已成為癌症治療的新支柱，在白血病和淋巴瘤治療中表現出顯著的應答率。在這些療法中，CARs作為合成免疫受體，可為T細胞提供針對惡性腫瘤相關抗原的新特異性，從而指導免疫系統攻擊和根除腫瘤細胞。

高溶解度SB蛋白變異體的設計和表徵

為了引入CAR基因，當前的方案依賴於病毒載體，該病毒載體提供有效的基因轉移，但是需要漫長而昂貴的生產才能用於臨床。病毒載體編碼的抗原決定簇也具有促炎反應的風險，轉錄區域的優先整合可能會導致不利的基因組變化。非病毒載體的使用可以提高安全性並降低成本，但是受到基因轉移效率，有限的轉基因大小和載體DNA或RNA的細胞毒性的限制。例如，非病毒基因組編輯核酸酶可以簡單，低成本地進行特定位點的基因組修飾，但它們依賴於DNA插入的同源性定向修復，通常在原代細胞中很少發生。

通過直接hsSB遞送進行高效的細胞工程

DNA轉座子是基因傳遞的另一種非病毒替代物。它們包含兩個基本成分：轉座酶和轉座子DNA，常規地，兩種組分均作為質粒DNA載體提供，並且轉座酶在靶細胞中表達。表達後，轉座酶蛋白特異性結合貨運載體的轉座子末端，切除轉基因並將其整合到靶細胞的基因組中（轉座）。隨著轉座子能夠插入DNA，它們引起的轉基因效率與慢病毒載體相似。同時，它們在免疫原性，插入特性，貨物容量（最大20–150 kb），臨床實施的複雜性和成本方面具有良好的屬性。

廣泛使用的轉座子系統是SB，它是從魚類基因組中的非活性拷貝重建的合成元件。由於其在脊椎動物中的高插入效率，SB已被用於功能基因組學，癌症基因發現，轉基因和基因治療應用。在醫學領域，SB已用於臨床1或2期臨床試驗中，用於治療性細胞的體外工程改造，包括生產用於癌症免疫療法的CAR T細胞。

然而，包括SB在內的當前轉座子系統的一個重要缺點是靶細胞中發生的轉座事件沒有得到很好的控制。特別是，使用轉座酶編碼的DNA會引起蛋白質表達的延長。對轉座酶暴露的時間和動力學缺乏控制會帶來進行性和不受控制的轉座，細胞毒性。對於SB，蛋白質聚集，低穩定性和低溶解度仍然是蛋白質生產和遞送的主要瓶頸。

hsSB轉座酶具有固有的細胞穿透特性

在該研究中，基於過度活躍的SB100X變體的晶體結構，使用了合理的蛋白質設計來創建具有增強的溶解性和穩定性的SB轉座酶（高溶解度SB，hsSB）。該研究證明，hsSB可以與轉座子DNA一起傳遞，以遺傳修飾細胞系和胚胎，造血和誘導多能幹細胞（iPSCs），克服了不受控制的轉座酶活性。研究人員使用hsSB生成嵌合抗原受體（CAR）T細胞，在體外和異種移植小鼠中均顯示出強大的抗腫瘤活性。有趣的是，該研究發現hsSB可自發穿透細胞，從而無需使用轉染試劑即可修飾iPSC和生成CAR T細胞。hsSB每個基因組僅進行兩次整合。

總之，該技術由於其簡單性和多功能性，與目前的標準相比，將大大降低製造成本，並有助於增加基因和細胞療法的可及性。

參考消息：

https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z