厲害！浙江大學一天內連發兩篇Science

北京時間10月25日浙江大學醫學院郭江濤課題組和基礎醫學系Dante Neculai教授團隊的兩項科研成果在國際頂尖雜誌《科學》上刊登。你是不是很好奇相關研究的具體內容

讓我們一起繼續往下看！

1、浙大研究刊登《科學》“看清”鉀-氯共轉運蛋白的結構，為治療癲癇提供新思路

人體細胞內的鉀、鈉、氯等離子穩態是受到嚴格調控的，離子穩態一旦失衡，就會導致高血壓、抑鬱、癲癇等一系列疾病。而在細胞膜上，有一類被稱為陽離子-氯離子共轉運蛋白的蛋白質，可以帶著離子進入和離開細胞，從而有效調控細胞內的離子穩態。不過長期以來，由於缺乏精確的結構信息，人們對這類蛋白的工作機理還不甚瞭解。

近日，浙江大學醫學院郭江濤課題組解析了這類蛋白質中的一個成員——人源鉀-氯共轉運蛋白KCC1的2.9埃的高分辨率冷凍電鏡結構，揭示了鉀離子和氯離子的結合位點，提出一個鉀-氯共轉運機理的模型，這將為相關的疾病治療和藥物設計提供新的視角。

團隊成員郭江濤、葉升和劉斯在討論課題

10月25日，這項研究刊登在國際頂級雜誌《科學》（Science）上。浙江大學醫學院劉斯博士、冷凍電鏡中心常聖海博士和物理系碩士生韓斌銘為文章的共同第一作者。

為何霧裡看花？

一般來說，人體細胞內的鉀離子濃度是高於細胞外濃度的。鉀-氯共轉運蛋白KCC利用這個鉀離子濃度梯度，將細胞內的鉀離子和氯離子一起轉運至細胞外，從而調控細胞內的氯離子濃度。

氯離子濃度是一個很關鍵的指標。例如，在γ-氨基丁酸介導的抑制性神經傳遞過程中，抑制性神經元需要維持細胞內較低的氯離子濃度才能發揮正常的抑制作用。正是由於鉀-氯共轉運蛋白中的一個成員KCC2不停地將細胞內的鉀離子和氯離子轉運至細胞外，使得抑制性神經元細胞內能夠維持較低的氯離子濃度。如果KCC2發生突變，抑制性神經傳遞就會受到破壞，這樣一來神經元會持續放電，從而引發各種神經系統疾病，如癲癇等。

既然KCC的功能如此重要，為何科研人員長久以來都沒有揭開這個家族的面紗呢？

圖為人源KCC1的結構。（A）KCC1的二聚體結構；（B）KCC1的鉀離子與氯離子結合位點。

郭江濤研究員介紹說，這主要受限於兩方面的因素。首先，鉀-氯共轉運蛋白的樣品獲得不容易。要想做結構研究，首先得有溶液狀態下的大量、均一的蛋白樣品。但因為鉀-氯共轉運蛋白在細胞內的本底含量很低，為了獲得大量的蛋白樣品，就需要將蛋白的基因包裹在桿狀病毒中，用桿狀病毒感染大量的哺乳動物細胞進行過量表達。在蛋白純化過程中，由於鉀-氯共轉運蛋白是定位於細胞膜上的膜蛋白，具有很強的疏水性，在水溶液中膜蛋白不穩定，易於沉澱，需要溶解在雙親性的去汙劑中。因此，鉀-氯共轉運蛋白的純化和樣品製備的過程比一般的水溶性蛋白更加複雜和困難。蛋白純化過程就像是大浪淘沙，培養幾升的細胞，經過逐步純化，最終才獲得100微克左右的蛋白樣品。

另一方面，較小分子量的膜蛋白的高分辨率結構解析一直具有挑戰性。如果採用傳統的晶體學解析這種膜蛋白結構，通常需要花費幾年的時間，而且就算投入大量的人力和經費，最終結果也往往不理想。近年來冷凍電鏡技術的發展為解析膜蛋白結構提供了便捷的途徑。不過，困難依舊存在。“冷凍電鏡通常對分子量大於150千道爾頓（道爾頓為相對原子質量單位，1道爾頓的質量等於1克的6.02×1023分之一）的蛋白質的結構解析非常有效，分辨率往往在3.5埃左右（1埃等於1米的一百億份之一）；但對於小分子量蛋白質的高分辨率結構解析仍然比較困難。”郭江濤說，以KCC1為例，最終解析結構的部分的分子量只有120千道爾頓，分辨率為2.9埃，這對於一般的冷凍電鏡結構生物學研究來說，是很不容易的。

飛越迷霧把你看清楚

劉斯經過大量的蛋白表達和純化條件的優化，最終獲得足夠量的可用於冷凍電鏡數據收集的KCC1蛋白樣品。此時，浙江大學冷凍電鏡中心的300 kv的高性能冷凍電鏡Titan Krios派上了大用場。

然而，有先進的冷凍電鏡，也不一定拍出好照片。生物大分子樣品對曝光非常敏感，電子的輻射會讓其受損傷。拍照只能在曝光時間短、劑量低的情況下進行，但這也直接導致了拍攝噪音大。“拍到理想的照片真可謂是一波三折，課題組的研究從2017年就開始了，但真正拿到高分辨結構已經是2019年初了。”常聖海說。

團隊成員在分析結構數據

為了減少電子對蛋白的輻射損傷，蛋白樣品需要在冷凍環境下進行數據收集。這又是個技術活。在數據收集前，科研人員用液態乙烷把蛋白溶液樣品快速冷凍在一張“銅網”上。銅網的每個目下面是一個方格，裡面有幾百個通透的孔，蛋白顆粒就被玻璃態的冰層包裹在這些孔中。但是，問題又來了，一般的冰層厚度在100-200納米之間，而KCC1蛋白的直徑在8-10個納米之間，就好像要在十幾米深的泳池裡尋找1米長的目標，噪音很大。

為了提高分辨率，劉斯和常聖海先是“削薄”冰層，然後再不斷調整參數，讓冷凍後的KCC1蛋白顆粒能夠密集而均勻地分佈在冰層較薄的區域。這樣不僅可以顯著降低冰層的噪音，提高分辨率，而且可以增加每張照片的蛋白顆粒數量，提高數據收集效率。

電鏡數據收集的過程，有點像電影的拍攝手法：在8秒的時間內連續拍攝40張照片，形成一個“微電影”。科研人員通過圖像處理，將微電影“疊加”成一張照片，這樣可以顯著提高照片的信噪比，獲得更為清晰的畫面。課題組從3000多部“微電影”中，挑出了一兩百萬個蛋白顆粒進行數據處理。經過層層篩選，最終用十萬個左右的高質量的蛋白顆粒進行高分辨率三維重構。

課題組最終獲得了兩套2.9埃高分辨率的KCC1的三維結構。“這項工作首先得益於近年來的冷凍電鏡技術的發展；劉斯和常聖海在蛋白樣品製備和數據收集處理方面的經驗和決心是課題取得進展的關鍵因素。”郭江濤這樣評價道。

令人興奮的發現

分析了KCC1的高分辨率三維結構後，研究人員發現KCC1是以二聚體的形式存在，它的跨膜區與胞外區均參與了二聚體的形成。在KCC1結構中，研究人員鑑定出一個鉀離子和兩個氯離子的結合位點；結合離子轉運實驗、分子動力學模擬、結構比較等方法，該研究闡明瞭KCC1以1：1的比例同時同向轉運鉀離子和氯離子的分子機理。

“闡明分子機理，不僅需要高分辨率三維結構，而且需要離子轉運活性實驗、分子動力學模擬進行驗證。範德比爾特大學的Eric Delpire和浙大物理系的李敬源團隊在這方面提供了專業的技術支持。”論文的資深作者葉升教授高度評價合作者的工作。

“物質的跨膜運輸是人體細胞與外界進行物質、能量和信息交換的重要途徑”，郭江濤介紹說，“在轉運鉀離子和氯離子的過程中，KCC1就好像細胞膜上有一個旋轉門，朝內這一側的門先打開，離子結合到KCC1上進入旋轉門內；然後朝外這一側的門打開了，離子從旋轉門釋放到細胞膜外。”

圖為KCC1共轉運鉀離子和氯離子的模型。第二個氯離子首先結合在第二位點，然後鉀離子和第一個氯離子結合；KCC1的構象由內向態向外向態轉變，鉀離子和第一個氯離子釋放至細胞外。

獲得了KCC1的高分辨率電鏡結構，將有助於下一步設計針對KCC的藥物，為治療癲癇等疾病提供幫助。文章審稿人認為：“這項工作揭示了一個令人興奮的人源轉運蛋白的結構。”

這項研究的主體工作在浙江大學完成，浙江大學冷凍電鏡中心為數據收集提供了大力支持。浙江大學醫學院的郭江濤研究員整合了德克薩斯大學西南醫學中心白曉辰團隊、天津大學葉升團隊、範德比爾特大學的Eric Delpire團隊以及浙江大學物理系的李敬源團隊等研究力量，體現了跨學科合作的優勢。該工作還得到了浙江大學醫學院楊巍教授、冷凍電鏡中心主任張興教授的幫助。該研究受到國家自然科學基金委、科技部重點研發計劃等項目的資助。

2、浙大學者《科學》刊文，揭示兩個重要蛋白“欲謀其政須在其位”的奧秘

先天性免疫反應是人體防禦外來病原體和應激物的第一道防線。這種快速非特異性的反應，依賴於模式識別受體對病原相關分子模式以及損傷細胞所釋放的損傷相關分子模式的快速識別。

胞質中的NOD蛋白就是在血液和小腸這兩大系統中的重要模式識別受體，其家族中的NOD1和NOD2是抗細菌免疫的關鍵模式識別受體，它們通過識別細菌胞壁成分肽聚糖來介導免疫應答信號途徑活化發揮重要作用。

Dante Neculai教授團隊

近日，浙江大學醫學院基礎醫學系Dante Neculai教授團隊研究發現，NLR家族的兩個重要受體蛋白NOD1和NOD2能夠在棕櫚酰轉移酶ZDHHC5的作用下發生棕櫚酰化修飾，從而介導細菌性炎症信號通路的發生。這一發現有效地連接起科學機理與臨床問題，未來在診斷和治療上或有重要價值。

這項研究，10月25日刊登在國際頂尖雜誌《科學》（Science），浙江大學醫學院基礎醫學系2015級博士生陸喦、2017級博士生鄭裕萍，加拿大Princess Margaret癌症研究所研究中心博士後Étienne Coyaud，浙江大學醫學院基礎醫學系講師張超為共同第一作者。浙江大學醫學院基礎醫學Dante Neculai教授、孫啟明教授、加拿大Princess Margaret癌症研究所研究中心Brain Raught教授、多倫多St Michael醫院Gregory D. Fairn教授為共同通訊作者。

“哨兵”如何在其位謀其政

NOD1和NOD2是炎症性腸病（IBD）的先天性免疫的重要識別受體，作為“哨兵”的模式識別受體，它們各有各的崗位，有的在“城牆”上工作，有的在“城牆”內工作。

很長一段時間，科研人員認為NOD1和NOD2蛋白這兩個“哨兵”主要在“城牆”以內的細胞質中工作，通過偵探“敵情”，進而釋放炎症因子招募下游的白細胞的吞噬病原菌或者修復受損部位，恢復細胞結構。

隨著研究的發展，科學家們發現NOD1和NOD2蛋白不僅在“防火牆”以內，而且還貼著“防火牆”工作。然而NOD1和NOD2蛋白缺乏結合膜結構域，天然與細胞膜“磁場不合”，那它們為什麼卻能在這裡防守呢？科學家們一直在尋找其中的奧秘。

ZDHHC5介導的NOD1/2棕櫚酰化在病原細菌感知過程的示意圖

Dante Neculai團隊的科研人員發現，NOD1和NOD2蛋白通過酯化修飾，把一個16碳的飽和脂肪酸連接到了細胞膜疏水層，這就好像一個“錨”把哨兵固定在城牆內側。

那麼誰給了NOD蛋白這個“錨”呢？科研人員繼續破案，發現是棕櫚酰化轉移酶（ZDHHC5）這個“司令”，把棕櫚酰脂肪酸這個“錨”，安放給NOD1和NOD2蛋白這兩個“哨兵”。這樣，它們就可以老老實實呆在城牆內側抵禦外敵（病原細菌）入侵。

錨定在“城牆”是這麼重要

NOD1、NOD2的工作機制是，ZDHHC5受到外來病原菌刺激後，對NOD1、NOD2進行棕櫚酰化修飾，進而這兩個蛋白可以到膜上工作，介導細菌內吞。隨著細胞質聯合形成內吞體，內吞體演變成晚期內吞體，之後各種各樣的水解酶，把細菌消耗降解，降解成片斷後，裡面的有效成分可以通過內吞體上的轉運體“通道”進入到細胞質中，進一步激活處於細胞質的NOD1、NOD2，激活下游的炎症反應。

在整個炎症通路中，很多科研人員思考的是為什麼要到“城牆”工作？

Dante Neculai指導團隊成員分析結果

病原物的入侵就如同發生，哨兵看到後，立即向大家報告，才能引來其他細胞一起“救火”。由此可見，作為哨兵的NOD1和NOD2在發現敵情並向下遊報告的工作，是整條通路中的重要一環。

“當激活炎症通路後，巨噬細胞就會釋放炎症因子，炎症因子能夠招募血液中更多的白細胞，去粘附在損傷和入侵部位，進而或修復這個部位，或吃掉病菌。”Dante Necula說，不把NOD蛋白錨定在細胞膜上，就不能有這一連串的反應。要是不釘在細胞膜上，離著八丈遠就無法第一時間彙報敵情，從而造成入侵病原的進一步感染，使疾病發生或惡化。原來一直知道“哨兵”定位特殊這個現象，但是不知道是誰讓‘哨兵’守護在那裡的具體分子機理。”

NOD1和NOD2是天然免疫研究的兩個模式分子，可以對病原識別等研究提供了重要的理論和實例借鑑。匿名評審專家表示，該論文顯示出作者們的研究工作非常嚴謹，多條線索闡明瞭文章主旨。這項研究發現具有很高的創新性，將會病原性免疫反應的領域引起廣泛關注。

為什麼是ZDHHC5這個“司令”呢？

科研人員順著細菌進入細胞的兩個線路去發掘線索，他們發現，不論是細菌直接入侵，還是通過內吞體間接進入細胞，都會發生棕櫚酰化，讓NOD1和NOD2帶上“錨”，然而棕櫚酰轉移酶有24個成員，確定哪一個才是真正的目標靶點是工作的重要部分。

科研人員將與NOD1和NOD2有關的互作蛋白都查了一遍，尋找“究竟是誰給了武器”，通過繪製網絡，目標聚焦在了ZDHHC5上。而且科研人員還發現，上膜和下膜還是一個循環的過程。ZDHHC5先從細胞中拿到“錨”，然後再轉移到NOD1和NOD2身上。當有外敵入侵時，會有更多催化信號。

Dante Neculai教授的團隊採用新的蛋白互作質譜聯用法(BioID)，酰基生物素置換法(ABE)及熒光素酶報告系統，基因敲除鼠等手段，發現NOD1和NOD2的棕櫚酰化修飾是影響其亞細胞定位及正確免疫應答功能的關鍵因素，並鑑定了NOD1和NOD2棕櫚酰化的發生位點及相應的棕櫚酰轉移ZDHHC5。ZDHHC5主要定位於細胞質膜，NOD1、NOD2能夠在此被棕櫚酰化從而定位於質膜。

小鼠骨髓巨噬細胞(BMDM)內源NOD1蛋白識別沙門氏菌侵染 野生型BMDM(左), ZDHHC5 敲除型(右）

另外，在沙門氏菌的侵襲下，ZDHHC5 能夠被招募於含病原菌的內體膜，從而吸引並修飾胞質內更多NOD1/2，使其定位於內體膜。各種SLC 家族的轉運蛋白將病原菌細胞壁中的肽聚糖組分轉運至細胞質中(如MDP, DAP)，棕櫚酰化修飾的NOD1和NOD2能夠識別並誘發細胞內NOD1和NOD2介導的免疫應答，從而促使入侵者被自噬降解及宿主細胞炎症因子的釋放。

“在全球範圍內，腸炎每年會造成成千上萬人的死亡。”孫啟明表示，目前的發現可以在臨床上為遺傳性腸炎提供診斷的新標誌。未來還有望通過設計治療方案，開發潛在化合物讓蛋白的功能恢復，從而緩解或者治癒炎症性腸病。

該研究受到科技部、國家自然科學基金委、浙江省自然科學基金等項目的資助。除了論文中列出的單位和作者，浙江大學公共科研平臺以及劉偉教授和魯林榮教授等為本項目的順利完成給予了大力的支持。

文字記者：吳雅蘭丨柯溢能

攝影記者：盧紹慶丨部分圖片由課題組提供