金納米團簇（Gold nanoclusters，AuNCs）是一種粒徑在2納米左右的納米材料，尺寸效應與表面配體相輔相成，使這類材料具有特殊的光學性質與催化活性等“類分子性質”。AuNCs的研究最早大約起始於2000年，後來由於其類分子性質不斷被髮掘，在2010年後進入了快速發展階段。但是總的來說，關於AuNCs的突破性研究已經逐漸減少，就在領域內的研究者開始調轉研究方向的關頭，2019年半年之內卻兩次在頂級期刊上出現了AuNCs的身影。一次是4月份，
Science 刊登了一篇有關AuNCs結構與載流子壽命的研究 [1]，由納米簇結構解析方面的大佬金榮超教授領導。而第二次就是今天要講的這篇，基於AuNCs的早期癌症尿檢，由帝國理工學院與麻省理工學院（MIT）的研究者合作完成，發表於Nature Nanotechnology。對於癌症，早診斷早治療將極大提高患者生存率，降低治療成本，但是現有的早期診斷方法大多靈敏度與特異性欠佳，或是成本過於高昂，使得早期診斷方法的成本與收益無法匹配，導致其難以普及。帝國理工學院的Molly Stevens教授與MIT的Sangeeta Bhatia教授合作，開發了一種將AuNCs與中性親和素（Neutravidin, NAv）結合的在體納米傳感器，將其注射進小鼠體內，再通過對小鼠的尿液進行簡單的顯色處理，來實現對結直腸癌的早期診斷。該納米傳感器成本低廉，且尿檢的方式具有無痛無創的特點，依從度高，是一種極具潛力的診斷新工具。
本研究使用的AuNCs的合成方式與TEM表徵。圖片來源：Nat. Nanotech.
AuNCs的合成需要含有巰基的模板，該課題組選擇了在合成AuNCs中最常見的谷胱甘肽（GSH）與功能化多肽共同作為合成模板。其中GSH主要承擔穩定AuNCs結構的作用，而功能化多肽則承擔了傳感作用。這些多肽的C端修飾了巰基，N端修飾了生物素（Biotin），序列中包含結直腸癌標誌物MMP9蛋白酶的酶切位點。TEM觀察可以看出，這些AuNCs的粒徑在1.5納米左右。
納米傳感器用於在體檢測蛋白酶活性的示意圖。圖片來源：Nat. Nanotech.
接著這些AuNCs與NAv混合，通過NAv與biotin的特異性結合作用，自組裝成納米傳感器。這裡使用的NAv其實是一種性質類似於我們熟知的鏈黴親和素（Streptavidin，SA）的蛋白質，二者都可以與biotin產生特異性結合，主要區別在於NAv的非特異性吸附遠遠低於SA，因此更適合在體內傳感中使用。組裝後的納米傳感器粒徑大約為11納米，通過注射進入小鼠體內，當與MMP9接觸時，MMP9會作用於功能化多肽將其切斷，使AuNCs從NAv上脫離下來。遊離的AuNCs由於粒徑很小，可以在腎的清除作用下排除體外，而NAv與未產生變化的納米傳感器，都因為粒徑較大而被腎小管截留。
尿液中存在的AuNCs因為具有擬過氧化物酶活性，向其中加入TMB與H2O2就會產生顯色反應，產生明顯的藍色。最後，可以通過比色法或者裸眼觀察得到尿液中AuNCs的量，從而反映出小鼠體內MMP9的濃度，實現診斷目的。
遊離AuNCs在體內的代謝情況研究及代謝後的催化活性。圖片來源：Nat. Nanotech.
該課題組首先研究了遊離的AuNCs在小鼠體內的代謝情況，以及代謝前後催化活性的變化。通過尾靜脈注射的方式向小鼠體內注射AuNCs，收集尿液並同時用比色法與ICP-MS分別間接與直接對AuNCs進行檢測，結果發現73±7%的AuNCs在注射後1小時通過尿液排出，且比色法與ICP-MS的結果具有比較好的吻合度。該結果說明AuNCs能夠比較高效地通過尿液排出，且體內的一番代謝不會對其擬過氧化物酶活性產生顯著影響。
利用熒光相關光譜，研究反應的動力學與選擇性。圖片來源：Nat. Nanotech.
通過在AuNCs上連接熒光染料Oregon Green，並利用熒光相關光譜技術，該課題組研究了納米傳感器在體外的選擇性與反應進程。結果顯示MMP9每分鐘能夠使3%的AuNCs從納米傳感器上游離下來，而干擾蛋白每分鐘只能使0.08%的AuNCs遊離。尺寸排阻色譜顯示，MMP9的切割能夠產生明顯的粒徑變化，從體外對該納米傳感器的可行性提供了有力的證據。
尿檢結果顯示，長有移植瘤的小鼠的尿液會呈現藍色。圖片來源：Nat. Nanotech.
毒性評價證明，該納米傳感器在細胞與動物層面均沒有顯著的毒性，完整的納米傳感器主要是通過肝臟進行清除，一般四周後就不會在體內被檢出。在此基礎上，該課題組用LS174T細胞構建了裸鼠移植瘤模型，並向其體內注射這種納米傳感器。注射後1小時取得小鼠的尿液樣本，加入TMB與H2O2引發顯色反應，結果顯示，移植瘤模型的小鼠的尿液會產生明顯的藍色，而健康小鼠的尿液則不會發生明顯顏色變化。為了證明這種變化是由MMP9的酶解作用引起的，該課題組同時設計合成了對凝血酶Thrombin具有響應的納米傳感器，結果發現將這種傳感器注射給攜帶腫瘤的小鼠後，不會在尿液中得到顏色變化，說明了該納米傳感器在體內的選擇性與特異性。
綜上，AuNCs的尺寸效應使其具有催化活性且可以被腎臟清除出體外通過尿液排出。利用這些特性，該研究設計了納米傳感器用於監測腫瘤微環境中蛋白酶的濃度，實現對癌症的尿檢。傳統的體液監測大都聚焦在如何精確、高靈敏地監測體液中原有的物質，而該方法卻另闢蹊徑，人為地使疾病狀態下尿液中會出現功能化的納米材料。當然了，這樣的方法必須要建立在確鑿的毒理學依據上，所以說這樣的方法如果想要轉化必然有很漫長的路要走。
Renal clearable catalytic gold nanoclusters for in vivo disease monitoring
Colleen N. Loynachan, Ava P. Soleimany, Jaideep S. Dudani, Yiyang Lin, Adrian Najer, Ahmet Bekdemir, Qu Chen, Sangeeta N. Bhatia, Molly M. Stevens
Nat. Nanotech., 2019, 14, 883-890, DOI: 10.1038/s41565-019-0527-6
參考文獻：
1. Zhou, M.; Higaki, T.; Hu, G.; Sfeir, M. Y.; Chen, Y.; Jiang, D. E.; Jin, R., Three-orders-of-magnitude variation of carrier lifetimes with crystal phase of gold nanoclusters. Science, 2019, 364, 279-282. DOI: 10.1126/science.aaw8007
https://science.sciencemag.org/content/364/6437/279
導師介紹
Molly Stevens
https://www.x-mol.com/university/faculty/34281
（本文由傳光簇供稿）
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