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上一講咱們說完了免疫組化的所有內容，這一講開始咱們來說說幾種常見的ELISA的做法。
ELISA幹啥用
我們在第七講中介紹Western的時候，解釋了Western的原理，也就是關於蛋白、一抗和二抗三個小盆友的故事。ELISA的原理本質上與Western一樣，只是隨著檢測的目的蛋白不同，原理略有調整，而已。Western的基本原理是將待測蛋白結合到一張膜上，然後依次用一抗識別蛋白，再用二抗識別一抗，最後顯色。Western操作時對樣本的處理使得Western檢測的樣本基本都是抗原而不是抗體，小夥伴們仔細想想，是不是也沒聽說過用Western來檢測哪種抗體的表達？ELISA在這一點上則有更多優勢。ELISA是將未處理（不煮、不固定）的樣本結合在塑料96孔板底（酶標板，這裡請參見小貼士1），再利用上述“手拉手”原理進行檢測，在保持蛋白原有空間結構這一點上，ELISA比免疫組化還要更勝一籌，
但是ELISA卻是沒有辦法在組織“原位”做的，所以每種方法都各有千秋。不過呢，正是由於ELISA可以人為地將不經處理的蛋白結合在載體上，這就賦予了ELISA一個得天獨厚的優勢，那就是ELISA不僅可以用來檢測抗原，還能用來檢測抗體，所以ELISA也因此成為如今應用最為廣泛的檢測抗體的方法。再加上ELISA檢測的是液體樣本，為體液、培養上清的檢測提供了便利。另外，ELISA還具有非常高的靈敏度，檢測蛋白的量級在皮克級（不過現在高靈敏的ECL發光液也讓Western檢測的靈敏度達到了皮克級）。ELISA的分類及原理
ELISA的種類有很多，我們經常用到的有兩種：夾心法和間接法。其中的夾心法又可以分為兩種：一種是雙抗體夾心法，檢測對象是抗原；另一種是雙抗原夾心法，檢測對象是抗體 。而間接法檢測的對象也是抗體。我們實驗中最常使用的是雙抗體夾心法測抗原和間接法測抗體，市面上的試劑盒大多也是這兩種。但是本俠還是把三種ELISA（兩種夾心法和一種間接法）的原理都簡單說一說，大家就當豐富人生閱歷吧，哈哈哈。
- 雙抗體夾心法檢測抗原：先把可與帶檢測抗原結合的抗體（可以理解為一抗）結合到酶標板上，這個過程叫做“包被”。然後加入含有帶檢測抗原的樣本，這個時候樣本里的抗原會跟事先結合在酶標板上的抗體結合，然後再加入另一種也能與該抗原結合的抗體（可以理解為二抗，這裡請參見小貼士2），但是這個抗體帶有酶標記（一般也是HRP，關於HRP大家可以看看之前對Western的介紹），接著不用本俠點破聰明的小夥伴們也會猜到，就是加入HRP的底物進行顯色反應，但是本俠相信就算你再聰明你恐怕也不一定能想到，這後面還有一個操作，就是顯色以後在合適的時間點需要終止反應（這裡請參見小貼士3），這個操作在Western和免疫組化裡是不涉及的，並且等後面的章節本俠說完流式細胞術你會發現，流式也不需要終止反應，因為流失抗體是熒光標記，連酶都不用，哈哈哈哈。
- 雙抗原夾心法檢測抗體：與雙抗體夾心法非常相似，不同之處就是將抗原和抗體的位置顛倒，也就是最先結合到酶標板上的是抗原，然後用這個抗原去抓樣本中的抗體，接著再用含有標記的抗原與被抓到的抗體結合，接下來同樣是顯色過程。這種方法本俠沒有操作過，不敢過多言論。
- 間接法測抗體：與上兩種夾心法不同。間接法是將抗原結合到酶標板上，然後加入含有待檢測抗體的樣本，此時樣本里的抗體會跟酶標板上的抗原結合，接著再用帶有酶標記的抗體與樣本中被結合在抗原上的抗體結合，後面是同樣的顯色、終止和檢測步驟。這種方法過程上跟Werstern和免疫組化幾乎一樣，但是本質上這種ELISA檢測的是抗體，而不是結合在載體上的抗原，所以性質上跟Werstern和免疫組化還是不同的。
豬豬俠小貼士
1. 做ELISA用的96孔板專業術語叫做酶標板（ELISA PLATE），外形與無菌96孔平底細胞培養板一毛一樣，帶蓋，實則內部結構別有一番設計。酶標板每個孔的孔底經過處理而變得對蛋白質具有高親和力，這樣才能在做ELISA的時候牢牢抓住抗原或者抗體。96孔平底培養板的板底當然也是經過處理的，但它的目的是為了改變對細胞的粘附力。酶標板和96孔平底培養板還有一個本質的區別就是透光性。酶標板在做完ELISA中的各個孵育步驟以後，要放在酶標儀裡面，用來檢測反應過後每個孔中樣本的吸光度，這就要求酶標板透光性又好又均勻，而96孔平底培養板卻沒有這個要求。
2. 我們在Western和免疫組化裡經常提到一抗和二抗，但是這裡雙抗體夾心法裡的一抗二抗，其實跟之前提到的一抗和二抗有本質區別，主要是二抗的不同。之前提到的二抗結合的是一抗，所以是一個抗抗體，而雙抗體夾心法裡的二抗，本質上還是個一抗，因為它結合的還是抗原，不是抗體，只不過它跟其它二抗一樣，也帶HRP標記，所以姑且也叫它二抗吧。
3. 關於為什麼ELISA要終止反應，而同樣是用HRP標記的抗體來檢測抗原的Western和免疫組化卻不用終止反應，本俠的想法是，可能與顯色的形式和結果的判定方案有關的。ELISA實驗完成後，酶標板裡的液體樣本會因為被檢測抗原/抗體的量不同而呈現不同深淺的顏色，然後用酶標儀來讀取這些帶有顏色液體的吸光值，按照吸光值的大小來反映被檢抗原/抗體的多少。由於是通過顏色的深淺來間接量化抗原/抗體的量，因此實驗過程中應該儘量減少干擾顏色變化的因素，而反應時間長短則是其中之一。也就是說，如果在加了HRP的底物以後任由反應無限進行，最終所有檢測孔裡的液體的顏色可能會變得一樣深。免疫組化反應以後也會在切片上出現顏色，但是免疫組化看的是切片上出現的顏色多少，而不是深淺，所以免疫組化不用顧及反應時間對顏色深淺的影響。至於Western，本俠真的不敢妄下論斷，純屬瞎猜地跟小夥伴們聊一聊。Western現在的顯色方案是利用酶和底物化學反應後生成的能夠產生熒光的產物，然後用成像系統檢測熒光，那麼Western不用終止反應的關鍵可能就在熒光上了，本俠個人無根據地言論想說的是，是不是熒光可表徵的動態範圍比顏色深淺能表徵的動態範圍要廣，所以Western可以任由反應進行而不用擔心熒光測不出差異，但是顏色就不行，顏色很容易變得看不出來深淺的差異。（寫這麼長一段，也不知道看不看的明白，看不明白會不會被打，嘻嘻嘻）
下一講我們將跟大家說說雙抗體夾心法測抗原和間接法測抗體的具體操作。
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