1：ChIP實驗研究轉錄因子，調控因子結合的DNA和組蛋白結合的DNA操作上最大的區別是什麼？
ChIP實驗中由於組蛋白在染色質中表達相對較高，也較穩定，所以組蛋白研究起來更為容易，一般需要105-106個細胞即可完成一個ChIP反應。轉錄調控因子表達水平很低，往往是瞬時表達，起始樣本量（細胞，組織）要是組蛋白的10倍，一般每個反應至少需要107個細胞。另外有些轉錄因子比較大，往往結合多個核小體，因此在染色質斷裂的時候，建議使用超聲斷裂染色質的方法。因為酶法是化學處理，消化的位點往往比較均一，多是在核小體的連接處，酶消化有可能將核小體斷裂的同時打斷轉錄因子與DNA的結合。
2：ChIP實驗中使用超聲方法斷裂染色質溫度不易控制，可能會使蛋白變性，影響ChIP結果，有沒有較好的優化方案？
ChIP實驗中超聲的優化一般從如下幾個方面考慮
1、不建議重複已發表的剪切方案而不進行優化。當儀器不同於文獻中所使用的儀器時，尤其如此。
2、目前有各種超聲破碎儀器，水浴和基於探頭的。在使用基於探頭的超聲破碎儀時，選擇一個適用於您的樣品體積的探頭。
3、在任何情況下，剪切參數都應當根據您的樣品體積、細胞密度和細胞類型而優化。
4、優化應當包括功率設置（超聲時間 vs. 間隙時間/休息時間）以及獲得長度為200 – 1000 bp的DNA片段所需的剪切循環數，每個優化實驗只優化一種參數；
5、注意時間和功率設置。過度破碎和太高功率設置會損害在免疫沉澱步驟中的表位。降低ChIP信號。
6、始終保持裂解液冰冷，間斷超聲，而不是連續，因為超聲處理產生熱量會使染色質變性。
7、在超聲破碎過程中避免氣泡。泡沫會導致蛋白質的表面變性，可能使染色質損失在氣泡中。為了避免這種情況，一開始設為較低功率，再逐步提高。
8、在優化條件時，每個超聲破碎循環後通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段的長度。剪切不足所產生大的不溶蛋白質:DNA:RNA複合物可能堵塞瓊脂糖凝膠的孔，並延緩電泳過程。通過消化蛋白質、逆轉交聯、酚:氯仿提取和沉澱來純化DNA。
3：染色質為什麼要片段化？片段化的長度為什麼是200-1000？片段化過度或不足對實驗會有什麼影響？
片段化的目的是確保高分子量染色質的蛋白質/DNA複合物是可溶的，能被ChIP抗體接近；為確保ChIP實驗有良好精度，一般片段化的大小在200-1000bp，一般300-600bp均能獲得較好的ChIP結果。如果小於200bp的話，蛋白的結合位點很有可能被打斷，原因是由於每個核小體結合DNA的序列長度為175bp，加上不同核小體間的linker DNA序列，這樣每個核小體結合DNA的最小序列大概在200bp左右，如果片段長度大於1000bp，您將會分離獲得包含目標序列的DNA，但所要研究的蛋白可能會離您目標序列有700個核苷酸的距離；如果過度片段化可能破壞抗原表位降低PCR效率，片段化不全導致樣本丟失，可能會獲得假陰性結果。
4：ChIP實驗中最關鍵的一步就是ChIP級別抗體的選擇，但是2011 年的一篇Nature文獻報道中顯示即使ChIP級別的抗體，結合特異性也只有70%左右，我如何選擇高特異性的ChIP級別抗體？
ChIP實驗中抗體的選擇是實驗成功的核心要素。在2011年Nat Struct Mol Biol [1,2]報道中通過斑點雜交和ChIP-chip試驗顯示，分別只有73%和78%的抗體具有較好特異性（圖1，圖2）。作者進一步通過WB檢測3個品牌表觀抗體的特異性，僅有一個品牌（Millipore）抗體通過特異性檢測（圖3），另外兩品牌抗體未通過特異性結合實驗。
(a) Western blot of anti-H3K4me2 (Millipore, 07-030, lot DAM1543701), anti-H3S10ph (Wako, 303-35199), and anti-H4K20me3 (Diagenode, CS-057, lot A9-002).
針對這種情況給大家推薦一個非常好的方法，通過全球最大抗體查詢網站CiteAb（http://www.citeab.com/）進行查詢，能夠獲得每個ChIP抗體的文獻引用次數（CiteAb顯示Merck旗下多種表觀遺傳抗體全球使用率排名第一）
Merck （含Millipore 和 Upstate 品牌）部分高文獻引用的表觀遺傳學抗體
5：ChIP實驗中需要選擇ChIP級別抗體，沒有ChIP級別抗體該怎麼選擇？如果我的實驗種屬比較特殊（果蠅，昆蟲，植物等）該怎麼選擇ChIP實驗抗體？
但是由於ChIP級別（ChIP驗證）過的抗體數量非常有限，所以當沒有ChIP級別抗體時，我們有如下3種方法可以考慮：
1-選擇IP/IHC/ICC進行嘗試，一般在這些實驗中抗體對蛋白的識別結構是native，和ChIP抗體識別結構較為相似；不建議嘗試Western blot抗體，因為WB抗體識別的蛋白結構多是denature，並不適合ChIP實驗；
2-將蛋白的序列放在NCBI上進行Blast，如果蛋白序列同源性與其他種屬或物種蛋白超過80%，可以嘗試跨物種抗體；
3-可以使用標籤抗體，但是標籤頁可能干擾轉錄因子並可能引入假陽性相互作用，因此需要設置好對。
6：免疫沉澱過程中瓊脂糖珠和磁珠有什麼區別，哪一種Beads的效果更好呢？
在早期文獻報道以瓊脂糖珠為多，瓊脂糖珠的優點是價格便宜，但是樣本需離心，時間長，另外珠子在離心過程中可能破裂。瓊脂糖珠存在非特異性結合，因此需要“預先清洗”染色質，除去可能與蛋白G瓊脂糖非特異性結合的蛋白質或DNA。另外分層不明顯，樣品容易丟失。
當前主流的方法是以磁珠方法較多，磁珠的好處是樣本無須離心, 操作時間短，另外磁珠表面光滑，背景低，因此無需封閉。磁珠還有一個好處是帶顏色，分層清晰，樣品不會丟失，但是磁珠需要需磁力架。因此在免疫沉澱是建議選擇磁珠的方法。
瓊脂糖珠和磁珠操作示意圖
左圖為瓊脂糖珠，右圖為磁珠
7：在免疫沉澱過程中Protein A和Protein G的beads的區別是什麼，我該如何選擇？我在免疫沉澱時抗體有時是兔源，有時是鼠源有沒有通用的beads進行選擇？
蛋白 A微珠與兔多克隆抗體表現出最高的親和力，而蛋白 G微珠與更廣範圍的抗體結合，包括大多數但並非全部種類的小鼠單克隆IgG。
當前還有一種Protein A/G 混合型磁珠，能夠為免疫沉澱提供最大的靈活性，綜合了蛋白 A和蛋白 G的結合特性，不用考慮不同種屬IgG親和力差異。此外，蛋白 A/G混合物通常比單獨使用蛋白 A或G富集的倍數更高，產生的背景更低。因此在免疫沉澱時建議使用A/G混合型磁珠。
下圖顯示用A+G混合型磁珠能夠顯著提高免疫沉澱富集倍數
8：我在免疫沉澱的時候，我的樣本、抗體和磁珠加樣和反應順序對實驗結果有什麼影響？有要求嗎？
一般有3種反應順序：
染色質樣本+抗體先反應，然後加磁珠；
抗體+磁珠先反應，然後加染色質抗體；
染色質樣本+抗體+磁珠 三者同時反應。
無論選擇哪種微珠，使用磁珠或瓊脂糖珠的順序可能影響您的ChIP信號。
第一種方法先將微珠與捕獲抗體共同孵育（室溫下幾小時，或4°C過夜），接著加入染色質（樣本），繼續孵育（4°C震盪孵育1小時至過夜）。增加孵育時間有可能增加背景和ChIP信號；然而，與靶點親和力低的抗體即使延長（過夜）孵育，也不產生明顯的ChIP信號。
第二種方法將抗體與染色質樣本先共同孵育，再加入微珠也能獲得和第一種反應順序相似的結果，均能較好的進行免疫沉澱反應。但是不建議同時加入這三個組分進行免疫沉澱反應，有實驗驗證顯示同時加入三個組分雖然能減少開展整個反應所需的時間，但是和上述兩種方法相比，結果較差。
9：ChIP實驗中最關鍵的結果是什麼？什麼樣的富集倍數被認為是陽性的結果？
ChIP實驗本身其實就是一個通過免疫沉澱反應驗證蛋白與DNA結合能力的實驗。因此結果一般包括兩個數據：免疫沉澱的效率（富集效率）, 蛋白與DNA 結合能力（富集倍數）。但是這兩個結果本身都是一個相對值，因為富集效率就是斷裂後的染色質分成兩部分，一部分進行免疫沉澱，一部分作為對照不進行免疫沉澱，然後兩者進行比較，得到一個百分比。富集倍數就是取兩個抗體進行免疫沉澱，一個是特異性的抗體，另一個是陰性抗體（和特異性抗體同種屬的lgG）驗證抗體是否有非特異性的結合，然後將這兩個抗體獲得的DNA進行比較，得到一個比值。因此無論是富集效率還是富集倍數其實都只是一個相對的結果，沒有特定的數值， 富集倍數的高低往往取決於蛋白質靶點的丰度，相對於低丰度的靶點，高丰度靶點有可能產生高的富集。一些實驗室將相對於IgG對照的5倍富集設為成功實驗的最低閾值。不過，最好將結果與已發表的結果比較，而不是固守設定值。
10：ChIP實驗中DNA的檢測在什麼情況下用PCR反應？什麼情況下用測序？
當檢測已知蛋白結合的DNA序列的時候，可以使用PCR反應進行檢測，PCR可以使用End point PCR和Q-PCR方法，在PCR的時候除了樣本組外，還需要設置input 對照，陰性對照和空白對照。PCR擴增片段長度200-400bp最佳，模板DNA片段過長，結合位點的鄰近DNA會出現一定程度的信號富集。
但是有些情況下，蛋白結合的DNA序列是未知的，這時我們需要使用ChIP結合測序（Seq）方法檢測，ChIP-Seq一般包括3個步驟：ChIP反應，文庫構建和測序。一般有兩種方法操作，一種使用普通ChIP試劑盒，獲得純化的DNA，然後交個測序公司，由公司進行文庫構建和測序。還有一種叫做ChIP-Seq試劑盒，這種試劑盒一般包括ChIP反應和文庫構建，僅需將構建好的文庫交給公司進行測序即可。
