解螺旋公眾號·陪伴你科研的第2145天
Elisabeth Bik博士解釋了為何老能找到WB的茬。
時至今日，雖然Western blot（WB）仍是穩坐在蛋白質研究技術的“頭把交椅”上。
但近年來因WB不斷被捲入學術造假的醜聞和風波中，致使它身後的批評和質疑也在與日俱增。
而這追根究底是因為WB的操作繁瑣且環節眾多，致使實驗者無意中犯錯的概率隨之增加，極大影響了其準確性和重複性，就造成了大家做得好像不是同一個“Western”的結果。
這也是科研新人們一致認為，就操作難度而言，WB在一眾實驗中名列前茅的重要原因。
所以，關於WB，幾乎每一經驗豐富的實驗老手都有著一本厚厚的血淚史。
雖然要獲得一張漂亮的WB結果並不容易，但想來每個實驗室都有一套獨屬於自己的“專屬秘方”。
如今，小編就將學術打假先鋒Elisabeth Bik對WB的獨家見解和操作攻略分享給大家。
Step1. 蛋白質凝膠電泳
首先，用合適的裂解液將細胞或組織均質化，以獲得蛋白質樣品。
將蛋白質樣品與loading buffer混合，進行煮沸變性（通常10min）以使蛋白質展開和拉伸並帶上負電荷。
配製凝膠時，先配分離膠，再配濃縮膠。
可根據目標蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，一般分子量越高，分離膠濃度越低；濃縮膠濃度多為5%。
值得注意的是，玻璃板清洗乾淨後，可用烘箱將水分晾乾，待溫度降至室溫後，再灌膠，避免產生氣泡；
加水液封時，速度要慢，用1ml搶沿著膠板上沿反覆移動，避免分離膠高低不平，影響蛋白分離。
將蛋白質樣品（上樣量為10ul）依次加到加樣孔中（請參見下圖）。
可先加Marker,如有空置的加樣孔，需加等體積的1×loading buffer，以防相鄰通道蛋白樣品的擴散。
施加電流後，所有帶負電荷的蛋白質樣品在各自的“通道”中從凝膠的頂部向底部緩慢移動。
先低壓（80V）電泳，使樣品充分濃縮，後高壓（120v）電泳，直至溴酚藍即將跑出膠面時終止電泳。
而後可用考馬斯亮藍或Ponceau染料染色將凝膠顯示出所有蛋白質，或通過印跡法檢測一種或幾種蛋白質。
通常，相比於移動速度緩慢的大蛋白，小蛋白質更接近底部，從而分離出蛋白質混合物的各種蛋白。
Step2. 蛋白質印跡
在這個過程中，需將分離的蛋白質轉移到膜上，然後與特異性抗體一起孵育，以研究均質樣品中許多蛋白質混合物中的一種或幾種蛋白質。
考慮到現階段多用PVDF膜，用之前需要將其置於轉移緩衝液中平衡至少5min。
轉膜前，需先提前配好1x轉膜液，放在4°C冰箱中備用。
轉膜需要在冰浴中進行，凝膠和轉印膜間不要留有氣泡，否則氣泡處的條帶可能就不能轉移到膜上了，同時要注意電極方向。
轉膜後的效果可通過麗春紅染色或預染Marker來判斷。
而後，室溫條件下用封閉液（5%BSA或5%的脫脂奶粉）將膜封閉1-2h，可降低背景。
值得注意的是，對磷酸化的抗體或生物素標記的抗體不能用脫脂奶粉封閉膜，只能用5%BSA。
封閉結束後，可將膜（稱為“印跡”）與針對特定目標蛋白的抗體（一抗，需用稀釋液稀釋）孵育。
建議4°C搖床過夜。
一抗孵育時，要注意一抗的種屬來源。
孵育後，將膜漂洗，以洗去所有未結合的抗體。
然後將膜與結合一抗的二抗孵育，以放大信號。
要注意，二抗的種屬要與一抗的來源相對應。
通常二抗具有放射性或化學發光基團，使其在X射線膠片或光敏膠片或數字掃描儀上可見。
通常，蛋白凝膠染色和印跡的結果如下圖所示。
Step3. 內參蛋白
Western blot 除了可以定性分析表達產物，還可以檢測目的蛋白量的相對變化。
在實驗中，可能存在總蛋白濃度測定不準確，或者蛋白質樣品在上樣時產生的操作誤差。
特別表達量不高時，蛋白定量或上樣的誤差很有可能影響結果的分析。
為了校正這個誤差，Western Blot實驗都需要進行內參檢測。
具體校正方法就是將每個樣品目的含量與內參含量相除，得到每個樣品目的蛋白的相對含量；再進行樣品與樣品之間的比較。
內參蛋白一般指的是由管家基因編碼表達的蛋白，其蛋白表達保持恆定。
比如，下圖1-8甬道中Protein A-D蛋白的含量有所不同，而內參蛋白（微管蛋白,Tubulin）的量卻保持相當穩定。
內參抗體種類很多，比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Lamin B等，大家可依據自己的實驗需求進行選擇。
另外，為了確保western blot結果的準確性和特異性，設置合適正確的對照也是必不可少，一般需要設置的對照如下——
陽性對照：明確表達檢測蛋白的組織或細胞，用於檢測抗體的工作效率；
陰性對照：明確不表達檢測蛋白組織或細胞，用於檢測抗體的特異性；
二抗對照：不加一抗，用於檢測二抗的特異性；
內參對照：檢測標本的質量和二抗系統
空白對照：不加一抗和二抗；用於檢測膜的性質和封閉的效果。
Step4. 結果的多樣性
根據以上步驟做出來的WB結果，蛋白質印跡帶的形狀和間距變化很大。
條帶的形狀可以像煎餅，啞鈴，魚，等等等等。
這取決於研究人員如何將樣品加載到凝膠上，蛋白質的量以及凝膠設備的特性。
然後，凝膠帶和背景上還有斑點、汙漬、劃痕、氣泡和其他不規則現象。
所有這些變化讓每個WB的條帶都應該是獨一無二的。
因此，如果有兩條非常相似的條帶，那就要懷疑下結果的真實性了。
比如下圖的A和D，能看出其中太過類似的條帶嗎？
—END—
10天領悟3分科研套路訓練營
閱讀更多 解螺旋 的文章
