最近的蛋白降解靶向嵌合體技術——PROTAC（PROteolysis TArgeting Chimera）持續受到製藥工業界以及投資圈的高度關注，過去所謂的“不可成藥”靶點似乎有了很大的轉機，在細胞治療、抗體藥和基因編輯等新技術風頭正盛的今天，PROTAC技術又將小分子藥物重新拉回聚光燈下。基於PROTAC技術，2013年耶魯的Craig Crews教授創辦了公司Arvinas之後，從2015年開始，默沙東、羅氏、輝瑞等製藥巨頭先後投入了十多億美元進行合作開發。PROTAC技術到底有哪些優勢抑或是挑戰呢？是否PROTAC技術前面是一馬平川，可以高歌猛進呢？為了讓廣大讀者深入瞭解PROTAC技術的發展源流以及該技術面臨的機遇與挑戰，BioArt特別邀請了近年來對PROTAC技術有獨特貢獻並開展了一些列靶向蛋白降解及相關藥物研究的清華大學藥學院
饒燏研究員撰寫了《PROTAC技術的機遇及挑戰》一文，以饗讀者！希望更多的讀者能夠深入的瞭解PROTAC技術本身，多一點思考。撰文丨 饒燏、孫秀雲、方芳（清華大學藥學院）
靶向蛋白質降解是近年來蓬勃興起並備受制藥工業界關注的研究領域，其中最具代表性的技術是小分子靶向誘導蛋白降解技術(Proteolysis targeting chimeras, PROTAC)。PROTAC是一項通過小分子化合物降解靶蛋白實現蛋白水平調節的新技術，以其獨特的作用模式而備受關注，同時作為一種新型藥物開發策略，PROTAC在克服耐藥性及傳統‘不可成藥’靶點方面也有巨大開發潛力【1-7】。PROTAC是一種具有雙功能的雜合小分子，通過合適的連接鏈將靶蛋白配體與E3泛素連接酶配體連接，促使目的蛋白（POI）與E3連接酶形成三元複合物，從而使靶蛋白接近泛素化系統，實現靶蛋白的泛素化，隨後被蛋白酶體的26S亞基識別，最終導致靶蛋白降解【8-11】。因此，PROTAC通過泛素-蛋白酶體系統可實現細胞內蛋白水平的調控。簡而言之，PROTAC是一種利用小分子進行化學敲降蛋白的策略。除上述所提及經典模式的PROTAC分子外，還有一些其它形式的蛋白降解策略，如：分子膠（Molecular glue）
【12】、LYTAC【13】、PhotoPROTAC【14-17】、AUTAC【18】、HomoPROTAC【19-23】等。限於篇幅，不在此處介紹。由於PROTAC 可降解整個蛋白，因此可清除激酶的酶活及非酶活功能。此外，PROTAC降解蛋白具有催化性，在引發靶蛋白泛素化之後，即可複合物中解離，並進入下一催化循環。因此， PROTAC可在非常低的劑量下發揮作用。傳統抑制劑發揮作用是位點競爭、位點佔據的作用模式，而PROTAC介導的降解是反覆迭代的模式，因此在靶蛋白突變或過表達情況下，PROTAC會表現出更好的耐受性。因此，PROTAC已成為當前新藥開發領域中最大熱點。2008年，Crews組報道了第一例基於非多肽小分子形式的PROTAC，實現了雄激素受體的降解【24】。此後，多個靶點的降解劑相繼問世。首例降解雄激素受體的PROTAC小分子利用眾所周知的MDM2-p53 PPI抑制劑—nutlin作為E3配體，儘管細胞滲透性很好，但是降解活性卻不盡如人意，毫摩爾級的PROTAC才可實現AR的降解【25】。同時，因為有研究表明，bestatin甲酯可以結合到細胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)上，導致其自泛素化並降解。因此，cIAP1也被用來作為E3連接酶的配體，參與PROTAC的設計。Hashimoto課題組實現了首例應用cIAP1降解細胞視黃醇和視黃酸結合蛋白(CRABP-I和II)
【26】。隨後，Crews及Ciulli組報道了VHL配體也可用於PROTAC的設計【27-29】。與此同時，研究發現CRBN是沙利度胺、泊馬度安、來那度胺等藥物免疫調節劑的作用靶點【30】。機制研究表明，這些藥物免疫調節劑結合CRBN後促進新底物的招募，例如Ikaros, Aiolos 和casein kinase 1A1 (CK1a)，從而引發新底物泛素化及隨後降解【31】。因此，CRBN逐步成為PROTAC技術中應用最廣泛的一種E3泛素連接酶【32】。在以上科學進展基礎上，近年來研究人員設計合成了多種PROTAC分子並實現不同類型靶蛋白的降解，用於各種疾病治療，包括癌症、病毒感染、免疫紊亂以及神經退行性疾病等。現階段PROTAC在各個治療領域正以迅猛勢頭髮展壯大，尤其是Arivinas公司近期公佈了ARV-110初期積極的一期臨床結果後【45】，PROTAC為新藥開發打開了新篇章，給工業界和學術界帶來了前所未有的機遇。當然我們也需要清醒得認識到在任何一種新技術的興起過程中，必將面臨很多新的問題與挑戰。正是在克服這些已知或未知的困難中，新技術才得以發展和完善，併產生更廣泛的應用和影響。以下我們簡要總結了PROTAC發展的幾個主要方向及需要面對的挑戰。
圖1.PROTAC作用模式【43】
第一，PROTAC可克服腫瘤藥物耐藥性
針對癌症的小分子藥物治療，除傳統化療外，激酶抑制劑領域在過去的二十多年裡取得了蓬勃發展【33】。這些激酶抑制劑已在臨床上取得了優異的治療效果，極大得改善了癌症患者的生活質量並有效得延長了患者的生存期。然而儘管激酶抑制劑十分有效，患者往往還是會在不同的時間內出現對激酶抑制劑的耐藥，造成疾病復發。因此腫瘤靶向治療導致的耐藥性是腫瘤研究所面臨的一個主要問題，如靶向表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的酪氨酸酶抑制劑吉非替尼，是治療非小細胞肺癌的一線藥物。但在治療過程中，患者會出現繼發性耐藥，從而導致治療效果下降或病情惡化。耐藥機制主要是治療過程中T790 突變；PIK3CA 途徑位點突變或缺失；旁路激活等【34】；如BTK共價抑制劑伊魯替尼，作為治療套細胞淋巴瘤的藥物，在臨床使用過程中，BTK會產生C481S缺失突變而形成耐藥【35】。除靶點發生突變外，很多耐藥原因是靶點出現過表達。因此，PROTAC通過降解整個靶蛋白而在耐藥靶點方面表現出更大的優勢，如靶向雄激素受體的ARCC-4可克服恩雜魯胺耐藥的前列腺癌
【36】，靶點BTK的L18I可克服C481S突變【37】。第二，PROTAC可通過降解整個蛋白影響非酶活功能
傳統的小分子藥物通常通過抑制靶點的酶活功能產生作用，而PROTAC可降解整個蛋白，所以PROTAC既可影響蛋白的酶活功能又可調控非酶活功能。如粘著斑激酶(FAK)是激酶同時也為多種信號蛋白提供支架，在腫瘤入侵、轉移的過程中起到至關重要的作用。但臨床上通過調節FAK激酶活性抑制FAK功能並不成功。因此,PROTAC提供了一種新的開發思路，即同時封閉FAK的酶活信號及支架功能。Crews課題組於2018年報道了一種高效、選擇性FAK降解劑，在FAK的激活並介導的細胞轉移和入侵等方面，PROTAC效果優於臨床候選藥物德伐替尼【38】。因此，這些結果表明PROTAC擴展了現有藥物靶點的可成藥空間並且可調節傳統小分子藥物難以調控的蛋白。
第三，PROTAC有望降解不可成藥的靶點
眾所周知，目前已知的蛋白靶點中，只有20-25%用於藥物發現，包括激酶、GPCRs、核激素受體、鐵離子通道。其餘部分仍有待探索，因此開發新的藥物靶點越來越受到關注。信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)在細胞生長、繁殖、凋亡、代謝、化學耐藥等過程中扮演極其重要的作用。但STAT3結構中沒有明顯直接的作用口袋，這直接阻斷了對STAT3抑制劑的開發，目前尚無有效藥物。儘管有研究報道一些具有抗癌活性的STAT3抑制劑，但其作用濃度需要毫摩爾級，且缺乏特異性。此外，誘餌寡核苷酸(dODNs)作為一種封閉STAT3活性的新策略，可通過與活化的STAT3二聚體結合將STAT3隔離在胞質中，從而抑制STAT3的活性
【39】。但裸露的ODNs無法跨過細胞膜，因此體內活性受到限制，並很快被血清核酸酶降解。而PROTAC在降解STAT3方面則展現出明顯的優勢，王少萌課題組發展的STAT3降解劑在體內體外實驗中均有較高活性（Cancer Cell | PROTAC利劍出鞘：王少萌團隊構建STAT3特異性小分子降解劑抑制腫瘤生長）【40】。單純表達KRAS並不能引發腫瘤，因為K-Ras無法得到活化，K-Ras可通過多種途徑活化，例如，與三磷酸鳥苷結合、被活化的細胞表面受體激活。除了基於蛋白的活化，K-Ras也可因為關鍵密碼子的突變而活化【41】。臨床上，高頻率的突變G12A, G12C, G12D, G12S, G12V, G13C and G13D,以及一些低頻突變均可活化K-Ras。這些突變密碼子與鳥苷三磷酸水解酶相互作用，使得K-Ras活化，最終導致腫瘤發生。K-Ras的活化給腫瘤藥物的開發帶來重重困難。因此PROTAC也有望通過降解蛋白來抑制K-Ras的活性。第四，PROTAC提供了一種新型的快速可逆的化學敲除方法
利用PROTAC建立蛋白敲降動物模型可以作為研究靶標基因功能序列丟失的有力補充手段。傳統遺傳性方法是通過基因改造來建立動物模型，例如，應用TALEN或CRISPR-Cas9等基因編輯技術。然而，這些技術通常難以達到快速可逆的效果，且其長週期、高費用的特點給研究帶來更多挑戰，尤其在非人類靈長類動物上。同時基因敲除模型因為潛在的基因補償或基因突變可能產生表型上的誤解。此外，動物激活代償通路的可能性增加也可能掩蓋表型。並且，對於那些在胚胎髮育期不可或缺的基因研究，目前還急需合適的工具。作為一種新型、快速、高效的產生蛋白敲降模型的方法，PROTAC可以作為現有遺傳性工具的一種有效補充手段
【42】。 圖2. PROTAC構建蛋白敲除模型【44】
PROTAC領域在快速蓬勃發展的同時，也有如下諸多挑戰亟待解決：1）目前針對非成藥靶點僅有一例降解劑報道【40】，未來還需要更多的案例來佐證PROTAC在非成藥靶點方面的優勢；2）目前已有報告關於某類PROTAC可能實際同時或單獨通過分子膠原理，引起靶蛋白降解【12】，而如何區分這兩者並加以融合應用也是未來的研究挑戰之一；3）PROTAC發揮作用是催化循環，因此傳統方法無法準確評估PROTAC的PK和PD性質，針對PROTAC分子，目前尚無成熟的PK和PD評價體系；4）如何快速有效篩選目標蛋白配體，尤其對於蛋白-蛋白相互作用; 5）如何更深入的理解降解活性，選擇性及可能的脫靶效應（基於不同靶點，不同細胞系，不同動物模型），如何理性設計PROTAC等，這些都是目前尚不明確且亟待解決的問題。此外，人基因組編碼超過600種E3泛素連接酶，然而目前用於PROTAC設計的E3連接酶(VHL, CRBN, IAPs 和 MDM2)寥寥無幾，如何拓展可用於PROTAC技術的E3泛素連接酶也是PROTAC所面臨的挑戰之一。相信通過學術界和工業界廣大同仁的共同努力，這些問題在不遠的將來都可以得到滿意的解答方案。
饒燏，清華大學藥學院，研究員、博士生導師、教育部青年長江學者，國家優秀青年科學基金，教育部新世紀優秀人才，樹蘭醫學青年獎及中源協和生命醫學創新突破獎獲得者。
1999年本科畢業於山東醫科大學藥學院，2002年碩士畢業於瀋陽藥科大學（導師陳吉祥教授），2007年於美國佐治亞大學化學系獲博士學位（導師 Geert-Jan Boons 教授），2007-2010年在紐約Memorial Sloan-Kettering Cancer Center任博士後研究員（導師 Samuel J. Danishefsky 教授）。2010年入職清華大學醫學院，任特別副研究員、博士生導師，並於2012年晉升為研究員。2014年起分別任美國化學學會雜誌ACS Medicinal Chemistry Letter編委，中國化學快報Chinese Chemical Letters青年編委，Chinese Journal of Medicinal Chemistry《中國藥物化學雜誌》編委。饒燏教授長期開展藥物化學與化學生物學研究，課題組通過跨學科交叉，綜合運用包括藥物化學，化學生物學，結構生物學，高通量篩選等多種技術手段，來尋找新型的，安全，高效的小分子化合物應用於臨床轉化醫學研究。
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