20世紀初，隨著科技的不斷髮展，設備越發精密，正如物理研究從宏觀世界轉入微觀世界一樣，科學界對於生物人體的探索也開始逐漸深入到微觀領域，開始思考如何去觀測單個蛋白質、病毒和細胞的自然狀態，從而破解生物發展之謎。
20世紀30年代，馬克斯·佩魯茨利用X射晶體學知識繪製出了血紅蛋白和肌紅蛋白的結構。血紅蛋白和肌紅蛋白是兩種存在於血液中和肌肉中的蛋白質，X光技術本來在當時多應用於探索晶體的原子結構，而馬克斯卻創新性地利用X光研究DNA的衍射。而這也標誌著生命科學從對生命現象的定性宏觀描述階段進入了對生命現象的分子機制的微觀描述階段，即進入了分子生物學時代。
X射線晶體學是一門利用X射線來研究晶體中原子排列的學科。更準確地說，利用電子對X射線的散射作用，X射線晶體學可以獲得晶體中電子密度的分佈情況，再從中分析獲得原子的位置信息，即晶體結構。
但是對於生物分子的進一步仔細觀測受限於設備的原因，再加上X射晶體學這種方法需要事先獲取這種大分子的晶體。儘管許多蛋白質和一些穩定的複合體能產生質量足夠高的晶體，但對於膜蛋白或動態的複合體來說，獲取晶體就不是那麼容易。所以這限制了對生物分子的研究。
同樣在30年代，也就是1931年的時候，厄恩斯特·盧斯卡和馬克斯·克諾爾研製了第一臺透視電子顯微鏡。展示這臺顯微鏡時使用的還不是透視的樣本，而是一個金屬格，經過近90年的發展，電子顯微鏡已成為現代科學技術中不可缺少的重要工具。
相比於材料科學的進步，電子顯微鏡一開始還並沒有應用於生物科學領域。原因在於生物樣品含水分才會穩定，而電子顯微鏡必須在高真空下才能工作，因此如何製作高分辨率生物電鏡樣品是個技術瓶頸。
傳統的重金屬負染技術，可以讓重金屬包被蛋白表面，然後脫水乾燥製作適合真空成像的樣品，但這會導致樣品分辨率降低（至多保存1.5納米）。設備的落後限制了科學家們探索的腳步，如何對設備進行革新，成為了科學界思考的問題。
掃描電鏡的樣品製備
到了60年代，英國劍橋大學MRC實驗室的阿龍·克盧格博士一直致力於生物大分子結構的研究，1968年，他和他的學生德羅西耶開創了基於負染的噬菌體病毒的電鏡三維重構技術。電鏡三維重構技術是電子顯微術、電子衍射與計算機圖像處理相結合而形成的適於分析難以形成三維晶體的膜蛋白等大的複合體三維結構的分析技術。而這也為冷凍電鏡的誕生奠定了基礎。電鏡三維重構技術依然沒有解決生物樣品分辨率的問題，並且當時如何保持生物大分子的結構信息並用電鏡收集這些信息再用計算機對這些信息進行處理的技術還不成熟。
如何保持生物樣品原子分辨率結構又適合電鏡成像呢？加州大學伯克利分校的羅伯特·格萊澤博士和他學生泰勒於1974年首次提出並測試了冷凍含水生物樣品的電鏡成像，可以有效降低輻照損傷對高分辨率結構破壞和維持高真空，實現高分辨率成像的新思路，這就是冷凍電鏡（CryoEM）的雛形。
1975年，亨德森將未脫離細胞膜的細菌視紫紅質直接放置在電子顯微鏡下進行觀察，藉助表面覆蓋的葡萄糖防止真空乾涸，並採用強度更低的電子束流，得出細菌視紫紅質在細胞膜上是規整排列且朝向一致。之後，在三維重構技術的基礎上，亨德森和同事獲得了細菌視紫紅質較為粗糙的三維立體結構圖像。從而得到了歷史上第一個非常粗糙的視紫紅質蛋白三維結構，證明了電子顯微鏡在生物領域的適用性。而這種方法也有其侷限性，這種方法只適用於排列有定規律的蛋白，如果它們是雜亂無章的， 這種方法就難以奏效了。
所以發明能夠對任何生物大分子都能進行觀測的設備成為了迫在眉睫的事情。
到了1978年，海德堡歐洲分子生物學實驗室（EMBL）小組領頭人雅克·杜波謝發現瞭如何向電子顯微技術引入水。發現水的玻璃化手段，從而發展了冷凍電子顯微鏡技術。
1981年，約阿希姆·弗蘭克完成了單顆粒三維重構算法及軟件Spider,利用計算機識別圖像把相同蛋白質的不同影子收集起來，並且將輪廓相似的圖像進行分類對比，通過分析不同的重複模式將圖片擬合成更加清晰的2D圖像。在此基礎上，通過數學方法，在同一種蛋白質的不同2D圖像之間建立聯繫，以此為基礎擬合出3D結構圖像。弗蘭克的圖形擬合程序被認為是冷凍電鏡發展的基礎。
而在1982年，雅克·杜波謝領導的小組把非晶的生物大分子（二十面體病毒）直接在電鏡載網上形成薄膜並快速冷凍，發現如此冷凍的生物大分子同樣可保持結構信息。由此開發出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術製作不形成冰晶體的玻璃態冰包埋樣品，雅克·杜波謝的開創性工作因此導致了今天廣泛應用的單顆粒冷凍電鏡技術的誕生。
在1990年，理查德·亨德森成功地使用電子顯微鏡拍攝到原子級分辨率的蛋白質三維圖像,並提出了實現原子級分辨率冷凍電鏡技術的可行性理論。從而標誌著冷凍電鏡的真正誕生。
理查德、杜波謝以及弗蘭克三人的開創性工作更是催生了結構生物學這一重要的學科。也讓他們獲得了2017年的諾貝爾化學獎。
它是物理與生物相交叉誕生而來的學科，它主要利用物理學方法，配合生物化學和分子生物學方法研究生物大分子結構與功能的新學科，如今它已成為分子生物學中最精確和最有成效的一個分支。各個層次的生命活動,都需要在分子水平上進行物質結構和功能的研究才能最終闡明其本質。
生物大分子是指生物體細胞內存在的蛋白質、核酸、多糖等大分子。每個生物大分子內有幾千到幾十萬個原子，分子量從幾萬到幾百萬以上。
而冷凍電鏡就是一種結構生物學技術，它和X 射線晶體學、核磁共振是結構生物學的三大支撐技術。它的發展基於三大思路，1.樣品冷凍(保持蛋白溶液態結構)；2.冷凍成像(獲取二維投影圖像)；3.三維重構(從二維圖像通過計算得到三維密度圖)。完整表述就是其解析結構的方法是通過用電子顯微鏡對冷凍固定在玻璃態的冰中的生物大分子進行成像，然後應用計算機對所攝取的生物大分子圖像進行圖像處理和計算，進而重構出生物大分子的三維結構。
雖然由於快速冷凍技術和電鏡單顆粒圖像處理技術的發明，使得應用生物大分子單顆粒冷凍電鏡可以解析結構，但是還有一些關鍵問題沒有解決，限制了冷凍電鏡解析結構到原子分辨率。冷凍電鏡急需得到進一步地發展。
X 射線晶體學
這也使得冷凍電鏡技術在結構生物學中容易遭到忽視，因為在已解析的一千多種膜蛋白結構當中，90% 以上都來自X射線晶體學，核磁共振在小分子量的蛋白結構解析中也發揮了重要的作用，而冷凍電鏡因為分辨率的原因，一直沒有得到進一步的發展。
到了2013 年，中科院物理所畢業博士生程亦凡使得冷凍電鏡技術有了質的進步，他的團隊應用新的電子探測技術，以近原子分辨率(3.4 埃)確定了在疼痛和熱知覺中起中心作用的一種膜蛋白 TRPV1 的結構，證實冷凍電鏡技術能夠解析重要小分子的結構，文章發表在《自然》雜誌上，立即引發震動。
膜蛋白 TRPV1 典型電鏡圖以及重建的結構示意圖
小分子，即OCO小分子。凡分子量小於500的分子稱之為小分子，小分子一般為簡單的單體物質。小分子就是分子量很小的天然化合物，通常是指分子量小於1000道爾頓（尤其小於400道爾頓小分子）的生物功能分子；它是具有生物活性的小肽、寡肽、寡糖、寡核苷酸、維生素、礦物質、小分子團水、植物次生代謝產物及其降解產物如苷元、黃胴元、甙元、生物鹼等。
冷凍電鏡技術的重大突破，讓研究人員開始重新審視它在結構生物學研究中的重要作用。研究人員無需將大分子樣品製成晶體，通過對運動中的生物分子進行冷凍，即可在原子層面上進行高分辨成像。冷凍電鏡技術的突破，把結構生物學從“靜態結構生物學”變成了“動態結構生物學”，把結構和功能真正對應起來。
因為冷凍電子顯微鏡技術的出現，我們能看到的微觀世界從圖片左側的樣子，變成了右側這樣。圖片來源：The Royal Swedish Academy of Sciences
除此之外數學、計算機領域的科學家也著手研究冷凍電鏡的圖像處理和自動化問題，化學家們則著重研究新的樣品製備技術，物理學家們又開始了新的征程，研究更深層次的電子成像方法和技術。
冷凍電鏡成為了結構生物學的一大熱門方向，冷凍電鏡技術的成熟，也讓蛋白質或複合蛋白結構解析領域諸多被稱為諾獎級的論文陸續發表。冷凍電鏡具體有什麼意義呢，它帶來了許多生物學突破，也推動了不少創新療法的開發。
冷凍電鏡樣品製作流程
任何物質包括生命物質都是由分子或原子組成的，而分子又是由原子組成的。物質的性質和功能是由其結構決定的，“結構決定功能”是自然界的法則，生命物質也不例外。物質的性質和功能取決於構成物質的分子之間的相互作用，而分子間的相互作用又取決於構成分子的原子之間的相互作用。如果我們能夠理解生物大分子之間的相互作用及其由相互作用導致的新功能，那將對我們解決許多基因性疾病以及癌症等問題提供了一個解決的方向。
如2019年， 美國科學家利用冷凍電鏡技術揭開ATP-檸檬酸裂解酶（ACLY）的神秘面紗，其或成為癌症治療的下一個主要分子靶點。
而如今，在對冷凍電鏡的運用上，得益於施一公先生的團隊，中國處於世界領先水準。
2015年8月21日，著名期刊《科學》刊登了施一公研究組關於剪接體分子結構和機理研究的論文《3.6埃的酵母剪接體結構》和《前體信使RNA剪接的結構基礎》。該項突破性的進展被科學界評論為“中國科學家近幾十年來對科學的最重大的貢獻之一”。
信使RNA被剪切、連接的原子模型
剪接體是指進行RNA剪接時形成的多組分複合物，主要是由小分子的核RNA和蛋白質組成。RNA是指核糖核酸，存在於生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。一直以來，對剪接體的結構解析是分子生物學裡最熱門的研究之一，然而剪接體具有高度複雜的結構，其結構解析的難度普遍認為高於RNA聚合酶和核糖體，從而令眾多科學家望而卻步。
施一公先生的學生白蕊和她帶領的團隊還首次解析了世界上最大、最複雜、最難獲得穩定樣品的pre-B complex近原子分辨率的三維結構。需要說明的是，白蕊可是一個90後哦～
釀酒酵母預催化剪接體前體和預催化剪接體的三維結構
這篇論文解析的pre-B complex結構是目前世界上已解析的唯一一個同時包含五種核糖核蛋白（snRNP）剪接體結構，它由68個蛋白和6條RNA組成。在該結構中，首次觀察到了剪接體組裝早期U1 snRNP對5’剪接位點的識別，以及五種核糖核蛋白之間的相互作用界面。與此同時，論文還報道了處於pre-B complex之後的另一個完全組裝的剪接體，即預催化剪接體B complex的高分辨率三維結構。
另外，完整的剪接過程主要分為8種不同的狀態：預催化剪接體的前體（pre-B），預催化剪接體（B），活化複合物（Bact），催化活化複合物（B*），催化步驟I複合物 （C），催化步驟II活化複合物（C*），催化後剪接體（P）和內含子套索剪接體（ILS）。
施一公研究組解析的酵母剪接體結構彙總
8種狀態之間差距甚大，只有把這8種狀態的結構都研究透了，才能從分子層面去理解RNA剪接的工作原理。截至目前為止，施一公先生的團隊是唯一掌握完整的剪接過程8種狀態結構的。
也希望施一公先生的團隊可以做出更多具有創新性的偉大成就。
冷凍電鏡發展的50年曆程，它不僅僅只是冷凍電鏡的誕生過程，它標誌著人類對於生物微觀領域的探索進一步加深，而在這一過程中提出的一些新方法新理論新成果可以說促進了整個科學界的發展，比如計算機技術與生物技術的融合運營，物理方法與生物學的結合等。
冷凍電鏡未來依然還有許多提升的空間，如何提高使用的效率。使得我們能夠快速獲得大批樣品的高清結構，無疑將加速這項革命性技術在醫藥領域的應用，成為新藥發現的常規工具，從而促進人類解決眾多的疑難雜症。當然，冷凍電鏡的進一步發展帶來的作用不僅於此，也期待著我們當下的年輕人也可以投入到科研之中，實現冷凍電鏡的再一次蛻變。
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