去年，波特蘭俄勒岡健康與科學大學生殖生物學專家Shoukhrat Mitalipov領導的中美韓 三國科學家宣佈，他們用CRISPR-Cas9基因編輯技術修復了人類胚胎可能導致心力衰竭的受損基因時，引起了批評人士對該報告的質疑。
【重磅】美國科學家完成第一個基因編輯的胚胎嘗試性研究
針對該研究，8月8日發表在Nature上的兩篇評論認為，胚胎可能尚未修復。同期發表在Nature上的還有Mitalipov等人的答覆，他們一項後續研究表明基因編輯是成功的。
2017年7月，Mitalipov等人用CRISPR技術修復了父本存在MYBPC3基因突變的人體胚胎，繼承這種基因的人經常會發生心力衰竭，通過切割基因允許細胞通過用正確的信息替換基因中來修復突變。
在之前的研究中，一般都是先對卵子進行受精，再注射Cas9酶和嚮導RNA進行基因編輯，但這種方法效率低下，因為後期胚胎混雜了被修復和未經修復的細胞，即出現了嵌合體現象。但Mitalipov等人的研究是在M期將CRISPR試劑與精子一同注入卵子中，進行突變基因的編輯。結果顯示：在58個胚胎中，有42個完全消除了基因突變，成功率高達72%，而且沒有發現脫靶現象。
質疑的聲音
此次，質疑的爭議點在於基因修復的機制，因為Mitalipov等人本打算以小的外來DNA片段提供正確的基因信息，但胚胎忽略了該修復模板。相反，胚胎使用了野生型母體等位基因被用作模板來修復突變位點的DNA斷裂，這種行為被稱為基因轉換。
基因轉換是指一個DNA序列替換同源序列的過程，使得序列在轉換事件後變得相同。基因轉換可以是等位基因的，也就是說同一基因的一個等位基因可以替代另一個等位基因，也可以是異位，這意味著一個旁系同源的DNA序列可以轉換另一個。
然而，這種現象通常發生在生殖細胞減數分裂時。受精後，卵子和精子的基因組位於受精卵的兩端，每個細胞都會被膜結構包裹好幾個小時，這一現象將使得CRISPR難以用母本同源序列來修復突變體父本等位基因 。
因此，南澳大利亞健康與醫學研究所的遺傳學家Paul Thomas說，發現胚胎發生這種類型的修復是完全出乎意料的。
如果人類胚胎確實忽略了外來的DNA片段，這可能是胚胎基因編輯治療遺傳疾病的一個大問題，因為遺傳疾病常常是在父母雙方都帶有錯誤基因時產生的。在那種情況下，沒有健康版本的基因可以進行復制和粘貼。
然而，Thomas及其同事提出，Mitalipov的研究小組可能根本沒有檢測到基因轉換，相反，帶有突變基因的染色體可能是被大片的切除而不是被健康基因替換，但會讓它看起來像發生了基因轉換，愚弄研究人員認為已經修復了。
科學家們都不是省油的燈，說到做到。他們設計了實驗，同樣通過顯微注射技術將CRISPR試劑送入小鼠的受精卵，使用了Cas9 mRNA而不是CAS9蛋白，因為這種方法已被證明能夠高效地產生靶向突變，總共產生127個由每個gRNA顯微注射的受精卵的胚胎。他們篩選了跨越gRNA靶位點的
300-600個鹼基對（bp）的聚合酶鏈反應（PCR）產物，並對PCR產物進行了Sanger測序。結果顯示，小鼠胚胎細胞和受精卵中CRISPR-Cas9介導的DNA切割後經常產生基因組的大片缺失。
他們認為，雖然小鼠和人類胚胎細胞存在的物種差異可能影響DNA的修復，但Mitalipov的研究不能肯定所謂的同源定向修復基因校正事件已經產生了純合的野生型胚胎。他們需要提供確鑿的證據排除大片缺失的存在，並且通過定量PCR分析以確認產生兩種野生型等位基因。
Thomas等人的疑慮不無道理，7月Nature上的一篇文章也提示CRISPR-Cas9技術可能導致廣泛的突變和遺傳損傷，其對基因組的造成的影響可能被“嚴重低估”。因此，在人類種系修飾的背景下準確基因分型的重要性不容小覷，未能檢測到大片缺失可能會導致潛在的臨床應用產生災難性後果。
與Thomas一樣，Dieter Egli等人也認為Cas9切割父本突變位點後導致的大片缺失能逃脫表徵。
此外，他們還提出野生基因型可以通過Cas9注射期間卵的活化而產生，不一定成功整合了精子基因組，可能產生的是僅含有母本基因組的單倍體或二倍體孤雌生殖細胞。雖然Mitalipov等人通過細胞遺傳學分析在胚胎產生的一些幹細胞系中證實了父本基因組的貢獻，但是沒有確定野生型幹細胞系是來自野生型精子，還是通過基因修正產生的。
最新的證據：排除大片缺失
“Egli等人的批評並沒有提出任何新的實驗數據，他們僅僅基於純粹的揣測而對我們的結果提出質疑。”Mitalipov在一份聲明中反駁道。
他們認為，在原始研究中，特異於突變父本等位基因的CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）被遞送到原核受精卵期或甚至在受精期間更早，因此父母同源物具有充分的物理相互作用和重組的機會。此外，Thomas等人使用的是Cas9 mRNA，加上物種差異都有可能影響編輯結果。
但口說無憑，研究結果勝於雄辯！
因此，為了排除大量缺失的可能性，Mitalipov等人決定對已發表的研究中的所有胚胎樣本進行大規模的重新測試。不得不說，研究人員是很拼沒錯了。
之前的研究中，他們使用了PCR擴增MYBPC3突變位點向上下游跨越大約250bp的534 bp片段，並進行了Sanger測序。而這次，為了檢測較大的缺失 ，研究人員重新設計另外8對長距離PCR引物，擴增成圍繞MYBPC3突變基因的不同長度片段，範圍從493bp到10,160bp。
首先，他們重新測試了16個胚胎，分別來自野生型母本和父本基因型（WT/WT）、CRISPR-Cas9進行S期注射的（WT/WT）以及非注射對照胚胎的野生型母本和突變型父本（WT/Mut）。
在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產物，結果發現：所有16個樣品中，引物PCR1、PCR2、PCR4和PCR5擴增了預期大小的單一條帶，儘管引物PCR6和PCR7擴增後可檢測到幾個較小尺寸的微弱條帶，但這些微弱條帶的Sanger測序未產生任何可讀產物，表明是
非特異性PCR引物結合。接下來，研究人員使用引物PCR3和PCR8對所有剩餘WT/WT胚胎以及對照組進行了2次額外的長距離PCR擴增，結果發現：引物PCR3擴增產生了預期的1,742bp的單一條帶；對於引物PCR8，除了與預期的10,160bp匹配的主要條帶外，在一些靶向和對照樣品中也可以看到一些微弱的較小尺寸條帶，但同樣地，Sanger測序表明非特異性引物結合。
最後，他們使用引物PCR3和PCR8擴增，測試了M期注射的WT/WT胚胎有無較大缺失，結果還是產生了預期的1,742bp或10,160bp大小的單一條帶，即未能檢測到大的缺失。
此外，全外顯子組測序（WES）顯示突變位點±5kb區域的測序深度沒有差異，即沒有任何大的缺失。
最新的證據：排除孤雌生殖
Egli等人推測此前M期注射組中嵌合胚胎的減少可能是由於受精失敗導致孤雌生殖發育，Mitalipov表示這些雜合胚胎不能起源於孤雌生殖，因為他們都攜帶父本的MYBPC3缺失。
針對孤雌生殖發育的可能性，研究人員發現M期注射的卵母細胞表現出正常受精形態上有兩個原核和兩個極體，與具有孤雌生殖活性不一致，並且從非注射對照和S期注射胚胎中獲得了類似的結果。
此外，M期注射組中的WT/WT胚胎的SNP分析結果清楚地證明了父本SNP（單核苷酸多態性）的保留。進一步地，短串聯重複（STR）測定結果也證實包含母本和父本的STR等位基因。因此，鑑於在所有分析樣本中檢測到父本對基因組的貢獻，可以排除孤雌生殖的可能。
對此，其中一篇Nature的通訊作者、紀念斯隆凱特琳癌症中心的發育生物學家Maria Jasin認為：“新報告提供了更有說服力的數據，但我仍然表示懷疑，在小鼠實驗中，基因轉換這種類型的修復很少發生，沒有理由認為人類胚胎更頻繁地進行修復。當然，不能否定存在這種修復的可能性。”
結語
針對Nature同期發表的3片文章，乍一看是科學家們的互懟，但實際上代表著一種嚴謹的科學精神，也表明了胚胎基因編輯受到了很大的關注，大家都想在應用到人體試驗之前，確保萬無一失。
Jasin和Thomas說，雖然人們樂觀地認為科學家能夠修復人類胚胎中突變的基因，但研究人員還沒有，考慮到基因編輯可能出現的所有問題，例如意外地進行突變，該技術是否有效存在著不確定的餘地，人們離其安全性的100％自信還有很長的路要走。
https://www.nature.com/articles/s41586-018-0381-y
https://www.nature.com/articles/nature23305
https://www.technologyreview.com/s/611837/us-scientist-who-edited-human-embryos-with-crispr-responds-to-critics/
https://www.sciencenews.org/article/researchers-confirm-crispr-edits-human-embryo-worked
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