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上一講咱們說完了免疫組化的所有內容,這一講開始咱們來說說幾種常見的ELISA的做法。
ELISA幹啥用
我們在第七講中介紹Western的時候,解釋了Western的原理,也就是關於蛋白、一抗和二抗三個小盆友的故事。ELISA的原理本質上與Western一樣,只是隨著檢測的目的蛋白不同,原理略有調整,而已。Western的基本原理是將待測蛋白結合到一張膜上,然後依次用一抗識別蛋白,再用二抗識別一抗,最後顯色。Western操作時對樣本的處理使得Western檢測的樣本基本都是抗原而不是抗體,小夥伴們仔細想想,是不是也沒聽說過用Western來檢測哪種抗體的表達?ELISA在這一點上則有更多優勢。ELISA是將未處理(不煮、不固定)的樣本結合在塑料96孔板底(酶標板,這裡請參見小貼士1),再利用上述“手拉手”原理進行檢測,在保持蛋白原有空間結構這一點上,ELISA比免疫組化還要更勝一籌
ELISA的分類及原理
ELISA的種類有很多,我們經常用到的有兩種:夾心法和間接法。其中的夾心法又可以分為兩種:一種是雙抗體夾心法,檢測對象是抗原;另一種是雙抗原夾心法,檢測對象是抗體
豬豬俠小貼士
1. 做ELISA用的96孔板專業術語叫做酶標板(ELISA PLATE),外形與無菌96孔平底細胞培養板一毛一樣,帶蓋,實則內部結構別有一番設計。酶標板每個孔的孔底經過處理而變得對蛋白質具有高親和力,這樣才能在做ELISA的時候牢牢抓住抗原或者抗體。96孔平底培養板的板底當然也是經過處理的,但它的目的是為了改變對細胞的粘附力。酶標板和96孔平底培養板還有一個本質的區別就是透光性。酶標板在做完ELISA中的各個孵育步驟以後,要放在酶標儀裡面,用來檢測反應過後每個孔中樣本的吸光度,這就要求酶標板透光性又好又均勻,而96孔平底培養板卻沒有這個要求。
2. 我們在Western和免疫組化裡經常提到一抗和二抗,但是這裡雙抗體夾心法裡的一抗二抗,其實跟之前提到的一抗和二抗有本質區別,主要是二抗的不同。之前提到的二抗結合的是一抗,所以是一個抗抗體,而雙抗體夾心法裡的二抗,本質上還是個一抗,因為它結合的還是抗原,不是抗體,只不過它跟其它二抗一樣,也帶HRP標記,所以姑且也叫它二抗吧。
3. 關於為什麼ELISA要終止反應,而同樣是用HRP標記的抗體來檢測抗原的Western和免疫組化卻不用終止反應,本俠的想法是,可能與顯色的形式和結果的判定方案有關的。ELISA實驗完成後,酶標板裡的液體樣本會因為被檢測抗原/抗體的量不同而呈現不同深淺的顏色,然後用酶標儀來讀取這些帶有顏色液體的吸光值,按照吸光值的大小來反映被檢抗原/抗體的多少。由於是通過顏色的深淺來間接量化抗原/抗體的量,因此實驗過程中應該儘量減少干擾顏色變化的因素,而反應時間長短則是其中之一。也就是說,如果在加了HRP的底物以後任由反應無限進行,最終所有檢測孔裡的液體的顏色可能會變得一樣深。免疫組化反應以後也會在切片上出現顏色,但是免疫組化看的是切片上出現的顏色多少,而不是深淺,所以免疫組化不用顧及反應時間對顏色深淺的影響。至於Western,本俠真的不敢妄下論斷,純屬瞎猜地跟小夥伴們聊一聊。Western現在的顯色方案是利用酶和底物化學反應後生成的能夠產生熒光的產物,然後用成像系統檢測熒光,那麼Western不用終止反應的關鍵可能就在熒光上了,本俠個人無根據地言論想說的是,是不是熒光可表徵的動態範圍比顏色深淺能表徵的動態範圍要廣,所以Western可以任由反應進行而不用擔心熒光測不出差異,但是顏色就不行,顏色很容易變得看不出來深淺的差異。(寫這麼長一段,也不知道看不看的明白,看不明白會不會被打,嘻嘻嘻)
下一講我們將跟大家說說雙抗體夾心法測抗原和間接法測抗體的具體操作。
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