新型SARS-CoV-2檢測方法—成本更低、靈敏度至1個RNA copy/μL

撰文 | Leon

責編 | 雪月

在當前疫情的大流行下,SARS-CoV-2檢測和診斷的需求是空前的,全世界的科學家正在努力開發各種各樣的檢測方法。理想的檢測方法應該不需要專門的設備,在不同的環境下都可以進行應用。而且,還應該在短時間內得到結果,結果易於解讀。

2020年4月28日,哈佛醫學院的Constance Cepko實驗室在medRxiv預印本服務器發佈了他們開發的基於RT-LAMP(reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification)的新型SARS-CoV-2檢測方法。只需常用的試劑和65度溫浴,不需要PCR儀,檢測結果會在30分鐘內以比色的形式呈現,每個樣本的成本僅為7美分(約人民幣5角)這項方法還可以檢測唾液中的SARS-CoV-2。更重要的是,該方法的靈敏度很高,檢測下限為每微升1個RNA拷貝。

新型SARS-CoV-2檢測方法—成本更低、靈敏度至1個RNA copy/μL

LAMP是一種快速DNA擴增的方法,需要六種DNA oligo與目標分子的8個不同區域雜交。在一種特殊的DNA聚合酶(strand displacing polymerase)介導下,反應中形成類似於環狀的DNA結構,進而進行快速的擴增反應。這種反應能夠在很短的時間內,在單一的反應溫度下產生微克級別的DNA[1]。此外,由於這種DNA聚合酶有反轉錄活性,LAMP也可以用來檢測RNA(RT-LAMP),也可以加入逆轉錄酶以提高反應的靈敏度。LAMP反應最後會產生大量的DNA,可以通過使用DNA染料來呈現結果,也可以簡單地通過溶液濁度升高,或pH的降低來反映結果[2]。其中,pH的變化足以使pH指示劑改變顏色,可以作為呈現結果的最佳方式。

在RT-LAMP反應中,每個循環為65℃,30秒。理想情況下,30分鐘後(第60個循環後)可以讀取結果。但為了增強顯色反應,也可以延長到40分鐘。作者針對SARS-CoV-2的ORF1ab設計了引物,該區域與其他密切相關的SARS-CoV並不高度保守。研究者比較了幾種方法,也對設計的引物進行了優化,最後得到了與其他方法相比表現最靈敏的方法。

除了使用RT-LAMP對SARS-CoV-2進行檢測外,作者還優化了樣品製備,以提高靈敏度,並保證樣品對實驗者的安全。作者發現RT-LAMP反應對去汙劑耐受,1.5% Tween 20或1%Triton X100對反應沒有明顯影響。RNA純化時會加入GuSCN來抑制RNase,RT-LAMP反應對GuSCN或另一種鹽NaI的耐受達到50 mM。為了快速滅活並裂解病毒顆粒,同時保護RNA,作者採用了TCEP和EDTA。

為進一步提高靈敏度,使其更便宜、更易獲得、更易於規模化,作者優化出一種能夠將病毒RNA濃縮的方案為了做到這一點,實驗者使用了一種非常廉價的二氧化硅顆粒懸浮液。這種懸浮液是把細小的二氧化硅顆粒懸浮在水中製成的。二氧化硅顆粒懸浮液是目前常用的核酸抽提試劑盒的前身,核酸在GuSCN或NaI存在下會與離心柱中的二氧化硅薄膜結合。這樣,加入了NaI和懸浮液,病毒RNA得到濃縮,RT-LAMP的檢測下限進一步下降到每微升1個RNA拷貝。這種方案不需要商業試劑盒,也不需要離心機。二氧化硅顆粒懸浮液很容易獲得,不需要專門的設備或昂貴的試劑,成本低。整套流程下來,每個檢測樣本的成本僅為7美分(約人民幣5角)

新型SARS-CoV-2檢測方法—成本更低、靈敏度至1個RNA copy/μL

樣本滅活和純化流程


最後,作者還想開發一種從唾液中純化病毒RNA的方法。用上述方案使病毒失活後,在加入二氧化硅顆粒懸浮液之前,由於絮狀物的存在,作者不得不使用離心機來分離出上清。儘管最後也能達到每微升1個RNA拷貝的靈敏度,但離心機的使用減少了這個方案的簡便性。研究者將邀請其他團隊一起合作,簡化唾液檢測的流程(比如使用簡易的離心機)。

新型SARS-CoV-2檢測方法—成本更低、靈敏度至1個RNA copy/μL

基於RT-LAMP的檢測靈敏度非常高(陽性顯示為黃色,陰性為紅色)


原文鏈接

https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.23.20076877v1.full.pdf


參考文獻

1.Nagamine, K., T. Hase, and T. Notomi, Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes, 2002. 16(3): p.223-9.

2. Calvert,A.E., et al., Rapid colorimetric detection of Zika virus from serum and urine specimens by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP). PLoS One, 2017. 12(9): p. e0185340.


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