撰文 | 虞莎
2020年4月9日，來自首爾大學/韓國基礎科學研究院 (Institute for Basic Science) RNA研究中心Narry Kim和Hyeshik Chang團隊在Cell雜誌上以"pre-proof"形式在線發表了關於SARS-CoV-2的最新研究成果——"The architecture of SARS-CoV-2 transcriptome"。文章報道了SARS-CoV-2病毒的轉錄組及RNA修飾，為研究病毒的生命週期和致病機理提供了重要的信息，同時也為疫苗的研製和開發提供了方向【1】。
今年2月，韓國疾病預防控制中心的研究員從一位COVID-19患者的體內分離了SARS-CoV-2病毒(BetaCoV/Korea/KCDC03/2020)【2】。Narry Kim實驗室與韓國疾控中心合作，獲得了SARS-CoV-2感染的Vero細胞，並提取了RNA樣品。研究人員利用兩種方法對獲得的RNA樣品進行了測序：納米孔RNA直接測序(Nanopore Direct RNA sequencing) 和DNA 納米球測序 (DNA nanoball sequencing)。兩種方法均顯示，在被感染的Vero細胞中，超過65%的mRNA轉錄本由病毒的RNA構成，說明SARS-CoV-2對宿主細胞的轉錄具有明顯的抑制作用 (圖1)。
圖1. 納米孔RNA直接測序和DNA納米孔測序結果——感染的細胞中SARS-CoV-2病毒RNA和宿主mRNA所佔的比例
SARS-CoV-2作為一種正義單鏈RNA病毒，在自身編碼的RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)的作用下，能夠合成全長的反義RNA鏈。利用反義RNA鏈作為模板，可以進一步產生正義基因組RNA (positive-sense genomic RNA, gRNA)和亞基因組RNA (subgenomic RNA, sgRNA)。病毒的gRNA與結構蛋白組裝成為新的病毒。sgRNA則相對較短，負責編碼輔助蛋白(accessory proteins)以及4種結構蛋白: 刺突蛋白(spike, S)，包膜蛋白(envelope, E)，膜蛋白(membrane, M)和核衣殼蛋白(nucleocapsid, N) (圖2)。現有的基因組註釋(GenBank: NC_045512.2)表明，SARS-CoV-2有6個輔助蛋白，分別由ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8和 ORF10編碼。本文的研究人員發現，ORF10的轉錄本在納米孔RNA直接測序的結果中並未被檢測到，而其在DNA納米球測序中也僅有一個讀長。由於OFR10與已知的蛋白都不具有同源性，且不存在於其他冠狀病毒中，所以SARS-CoV-2 的ORF10很有可能並不表達【1】。
圖2. SARS-CoV-2 gRNA和sgRNA的大小以及編碼產物
在兩種測序結果中，研究人員都檢測到了新的重組轉錄本(圖3A)。這些重組RNA有的保留了正確的讀碼框，但是尚不清楚它們產生的機制和功能。與真核生物的mRNA類似，SARS-CoV-2 具有Poly(A)尾巴的結構。Poly(A)尾巴對於RNA的穩定性和蛋白質的翻譯具有重要的調控作用。已有的研究表明，牛冠狀病毒 (bovine coronavirus) RNA Poly(A)尾巴的長度在宿主細胞內隨著侵染時間而變化【3】。藉助納米孔測序對單個分子"從頭到尾"測序的優勢，研究人員檢測了SARS-CoV-2 RNA Poly(A)尾巴的長度。發現病毒RNA的Poly(A)尾巴平均由47個腺苷酸構成，全長的病毒RNA比sgRNA的Poly(A)尾巴更長(圖3B)。關於SARS-CoV-2 RNAPoly(A)尾巴的功能以及產生/調節的機制，還有待進一步的研究。
圖3. SARS-CoV-2轉錄組中的重組RNA以及不同RNA的Poly(A)尾巴的長度
納米孔RNA直接測序以RNA分子作為測序對象，根據每個核苷酸通過納米孔產生的電流信號不同，對A/U/C/G進行識別，同時能夠檢測帶有修飾的核苷酸【4】。研究人員以體外錄的不含任何修飾的SARS-CoV-2 RNA作為對照，發現病毒RNA上存在41處潛在的RNA修飾位點。這些 RNA修飾在基因組28,500–29,500位置處富集，並且大部分位於AAGAA模塊(圖4A)。進一步的研究發現，帶有修飾的病毒RNA具有更短的Poly(A)尾巴(圖4B)。儘管SARS-CoV-2 RNA修飾的類型、功能，以及RNA修飾和Poly(A)尾巴的關係尚不清楚，但是本文的工作為SARS-CoV-2的轉錄組和表觀組都提供了重要的信息，也為後續對SARS-CoV-2致病機理的研究提供了新的方向。
圖４ 病毒RNA修飾位點及Poly(A)尾巴
原文鏈接: https://www.cell.com/pb-assets/products/coronavirus/CELL_CELL-D-20-00765.pdf
參考文獻
1. Kim, D., Lee, J.Y., Yang, J.S., Kim, J.W., Kim, V.N., and Chang, H. (2020). The architecture of SARS-CoV-2 transcriptome. Cell. DOI: 10.1016/j.cell.2020.04.011
2. Kim, J.M., Chung, Y.S., Jo, H.J., Lee, N.J., Kim, M.S., Woo, S.H., Park, S., Kim, J.W., Kim, H.M., and Han, M.G. (2020). Identification of Coronavirus Isolated from a Patient in Korea with COVID-19. Osong Public Health Res Perspect 11, 3-7.
3. Wu, H.Y., Ke, T.Y., Liao, W.Y., and Chang, N.Y. (2013). Regulation of coronaviral poly(A) tail length during infection. PLoS One 8, e70548.
4. Garalde, D.R., Snell, E.A., Jachimowicz, D., Sipos, B., Lloyd, J.H., Bruce, M., Pantic, N., Admassu, T., James, P., Warland, A., et al. (2018). Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nat Methods 15, 201-206.
閱讀更多 BioArt 的文章
