人源類器官證實SARS-CoV-2感染和損傷膽管組織

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染引起的疾病(COVID-19)已對公共衛生構成重大威脅。COVID-19的主要臨床症狀是發熱和咳嗽,部分患者出現急性呼吸窘迫綜合症及多器官衰竭等重症。值得注意的是,部分COVID-19患者肝功能出現異常,表現為丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、鹼性磷酸酶(ALP)或總膽紅素(TBIL)高於標準範圍

【1】。鍾南山院士團隊對全國範圍1099例COVID-19患者的臨床研究發現約20%的患者ALT和AST升高,約10%的患者TBIL升高,特別是重度患者肝損害的發生率明顯高於非重度患者,提示患者發生了不同程度的肝損傷【2】。然而,COVID-19患者肝損傷是由肝內病毒感染直接引起還是由細胞因子風暴等系統原因間接引起尚不清楚。


疫情爆發之後,科學界針對SARS-CoV-2病毒的結構、功能和靶點開展了廣泛研究,證實SARS-COV-2主要利用血管緊張素轉化酶2(ACE2)作為受體進入宿主細胞【3】。ACE2的表達廣泛分佈於人體組織,包括肺、肝、腎和多個消化道器官【4】。近期來自復旦大學藍斐團隊的研究顯示,在健康人肝臟中,膽管細胞中的ACE2的表達水平和比例顯著高於肝實質細胞【5】


目前對SARS-CoV-2致病機制的研究主要依賴於生物信息學分析、臨床特徵分析、動物模型以及珍貴的遺體解剖報告,尚缺乏人體組織感染模型。


2020年3月17,復旦大學趙冰張榮林鑫華,中國醫學科學院基礎醫學研究所梁俊波合作在生物預印本平臺bioRxiv上發表研究論文“Recapitulation of SARS-CoV-2 Infection and Cholangiocyte Damage with Human Liver Organoids”,建立了人源類器官的SARS-COV-2感染模型,確定SARS-COV-2可以感染膽管細胞,並下調膽管組織中細胞緊密連接及膽汁酸轉運相關基因的表達,為新冠病毒細胞嗜性、致病機制研究和後續藥物研發提供重要工具,並提示膽管功能紊亂可能是部分新型冠狀病毒感染者肝臟損傷的誘因。


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在本項研究中,研究者應用人源肝臟類器官建立SARS-CoV-2感染模型,並研究其感染和損傷膽管組織的機制。人源類器官是由人體組織體外3D培養產生的,結構功能與體內組織器官高度相似的微型器官,可於體外模擬體內生理病理過程中的組織細胞行為。


研究者從臨床肝臟手術中分離獲取人膽管細胞,培育出可穩定傳代的肝臟膽管類器官,應用單細胞RNA測序(scRNA-seq)對類器官中膽管細胞進行了轉錄組分析,發現長期培養的肝臟膽管類器官保存了ACE2+的膽管細胞類群,而此細胞類群在小鼠肝臟膽管類器官中並未發現。提示人肝臟膽管類器官可以模擬ACE2介導的SARS-CoV-2感染。


接下來,研究者檢測了類器官對SARS-CoV-2的易感性。研究者從上海一位COVID-19患者中分離並純化了SARS-CoV-2病毒,接種感染來不同個體的膽管類器官。感染24小時後對類器官進行免疫熒光染色發現,SARS-CoV-2的核衣殼蛋白(N protein)在部分類器官膽管細胞中呈陽性,而未感染對照組無信號,顯示病毒已經成功侵染並複製,受感染的膽管細胞還會經膜融合形成合胞體。對SARS-CoV-2基因組RNA的qRT-PCR分析顯示,在感染後24小時類器官內的病毒載量顯著增加。這些數據表明,人膽管上皮細胞是SARS-CoV-2的易感宿主,並可支持病毒的活躍複製,人源類器官可作為研究病毒嗜性和致病機制的工具。


感染48小時後,類器官內的病毒載量明顯下降,提示SARS-CoV-2感染可能導致宿主細胞死亡或抗病毒反應的激活。研究者進而關注和檢測了病毒感染對類器官整體行為特性的影響。在體內穩態條件下,膽管的主要功能是將肝實質細胞分泌的膽汁酸轉運到膽管腔內排出。膽管細胞之間的緊密連接維持了膽管上皮的屏障功能,對膽汁酸的收集和排洩至關重要。研究者發現SARS-CoV-2感染降低了類器官中Claudin1的表達,提示膽管細胞的屏障功能可能被破壞。更重要的是,兩個主要的膽汁酸轉運蛋白,頂端鈉離子/膽汁酸轉運體(ASBT)和囊性纖維化跨膜電導調節(CFTR)的表達在SARS-CoV-2感染後顯著下調。這些數據支持SARS-CoV-2感染可以通過下調膽管細胞中緊密連接形成和膽汁酸運輸關鍵基因的表達水平,損傷膽管組織屏障和膽汁酸運輸功能。提出COVID-19患者肝內病毒感染誘發膽管功能紊亂和膽汁積淤,進而導致肝臟損傷的可能性。


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圖注:新型冠狀病毒(SARS-COV-2)感染和損傷肝臟中膽管上皮細胞


本文是COVID-19疫情爆發之後利用人源類器官研究SARS-CoV-2感染和致病機制的首次報道。除了肝臟之外,其他重要臟器(肺、腸和腎等)的類器官培養技術也日漸成熟,廣泛利用人源類器官研究SARS-CoV-2在多臟器中的病毒嗜性、複製動態以及先天免疫應答值得期待。相比於複雜動物模型,類器官病毒感染模型進行的新型抗病毒藥物藥效和毒性評價將更加直接和便捷。


復旦大學生命科學學院研究員趙冰、博士後倪超和中國醫學科學院基礎醫學研究所博士研究生高然為本文共同第一作者,趙冰梁俊波張榮林鑫華

為本文共同通訊作者,中國醫學科學院基礎醫學研究所王曉月研究員和復旦大學基礎醫學院袁正宏教授為本文高級作者。


原文鏈接:

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.16.990317v1


參考文獻


1. Fan, Z. et al. Clinical Features of COVID-19 Related Liver Damage. medRxiv (2020).

2. Huang, C. et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(20)30183-5 (2020).

3. Hoffmann, M. et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell, doi:10.1016/j.cell.2020.02.052 (2020).

4. Zhao, Y. et al. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov. bioRxiv, doi:10.1101/2020.01.26.919985 (2020).

5. Chai, X. et al. Specific ACE2 Expression in Cholangiocytes May Cause Liver Damage After 2019-nCoV Infection.

bioRxiv doi:10.1101/2020.02.03.931766 (2020).


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