SARS-CoV-2感染的恆河猴模型中，康復後不會再次感染

撰文 | 唐小糖

自2019年12月SARS-CoV-2引起的COVID-19爆發以來，已對中國乃至全球構成重大的的公共衛生威脅。截至3月15日，全球40多個國家/累計確診人數超過15萬，死亡人數近6千人，目前尚無好轉跡象。動物模型對於闡明病毒感染與發病機制、傳播途徑以及抗病毒藥物和疫苗評價至關重要。2020年3月9日，Nature發表新聞，實驗室競相開展SARS-CoV-2的動物模型研究，曾為SARS-CoV研發的轉基因小鼠供不應求【1】。此前中國醫學科學院實驗動物研究所秦川團隊研製的動物模型已於2月18日通過科技部組織的鑑定，率先建立了COVID-19的轉基因小鼠模型和恆河猴模型【2】。轉基因小鼠模型的研究經過兩次修改，已於2月28日將該第三版本的論文上傳至預印版bioRxiv，該研究闡明瞭hACE2小鼠中SARS-CoV-2感染的致病性，促進了抗病毒藥物治療研究和疫苗開發【3】。

2020年3月14日，中國醫學科學院實驗動物研究所、北京協和醫學院秦川團隊在預印版bioRxiv上同時發表了兩篇研究論文：“Reinfection could not occur in SARS-CoV-2 infected rhesus macaques”和“Rhesus macaques can be effectively infected with SARS-CoV-2 via ocular conjunctival route”，建立了恆河猴的SARS-CoV-2感染模型，闡述了恆河猴的COVID-19特徵，確定了SARS-CoV-2的氣道感染和結膜感染途徑以及康復後不會發生再次感染現象。值得注意的是，秦川團隊此前曾於2005年和2014年先後建立SARS-CoV感染和MERS-CoV感染的恆河猴模型【4-5】。

研究者對4只恆河猴氣道接種半致死劑量的SARS-CoV-2，對體重、體溫、X光、血清學和各種拭子樣本進行檢測，發現有3只猴子感染後7天體重略微減輕，所有猴子均未觀測到直腸溫度變化，臨床數據表明在接種病毒後出現暫時性食慾下降、呼吸率提高和弓身現象。鼻拭子和咽拭子在感染後3天病毒載量最高，隨後開始下降。同樣地，肛拭子病毒載量第3天最高，第14天下降到檢測限以下。

圖1. 恆河猴SARS-CoV-2感染模型的實驗設計和樣品收集

為了識別SARS-CoV-2在猴子體內的分佈以及組織病理學變化，在感染後第七天，對其中1只猴子實施安樂死並解剖，發現病毒廣泛分佈在鼻、咽、肺、腸道、脊髓、心臟、骨骼肌肉和膀胱組織內。此外，通過HE染色和抗SARS-CoV-2的S蛋白抗體染色，確認病變主要發生在肺部，呈現間質性肺炎症狀，特徵是肺泡隔膜變厚、肺泡巨噬細胞積累、肺泡上皮退化和炎症細胞滲透。繼續跟蹤其餘3只猴子，發現與感染後第3天和第7天相比，抗SARS-CoV-2的特異性抗體在第14、21和28天水平顯著升高。事實上，中國科學院武漢病毒研究所

圖2. SARS-CoV-2感染的恆河猴臨床特徵、病毒複製和免疫反應

此前有報道SARS-CoV-2感染的出院病人在康復後檢測再次呈陽性，但目前還不清楚康復患者是否有"復發"或"再感染"的風險。於是研究者在其餘的猴子康復後進行再次感染以評估風險，再感染前的3只猴子符合臨床出院標準，即無臨床症狀和放射異常，兩次RT-PCR檢測陰性。 將其中的兩隻猴子以相同的半致死劑量進行SARS-CoV-2再感染後，體重未發生變化，體溫有短暫性增加，在鼻拭子、咽拭子和肛門拭子中均檢測不到病毒載量。再感染5天后，將其中一隻猴子安樂死並解剖，發現所有組織中均沒有病毒複製，肺組織也無任何病理損傷和病毒抗原。未安樂死的另一隻猴子胸部X光顯示沒有異常。以上結果表明，在感染SARS-CoV-2的猴子康復後不會再感染相同的毒株，且恢復後的猴子也沒有出現復發情況。血清學證據也顯示在隨後受感染的猴子中沒有發現抗體依賴增強（ADE）作用。基於以上結果，研究者評估認為在初次感染的早期階段，猴子體內已產生中和性抗體足夠抵禦SARS-CoV-2，另一方面，在再感染的猴子的所有組織均檢測不到病毒複製，意味著SARS-CoV-2在體內可能不會存留很長時間，所以“復發”或“再感染”的病人可能是由於檢測的“假陰性”造成的。綜合結果表明，初次感染SARS-CoV-2康復後產生抗體可以預防再次感染，這對疾病預後和疫苗設計具有重要作用。

圖3. SARS-CoV-2感染的恆河猴病理切片和胸部X光的跟蹤檢測

基於SARS-CoV-2潛在的人結膜感染途徑，研究者利用以上恆河猴模型對SARS-CoV-2的結膜感染途徑進行研究，對3只恆河猴進行半致死劑量的SARS-CoV-2感染，其中2只選擇結膜感染，另1只通過氣道感染作為對照。在感染後的1、3、5和7天收集拭子樣本，通過不同感染途徑比較宿主中病毒的分佈情況以及發病機制，對臨床症狀、病毒載量和血清反應進行檢測。結果顯示，所有猴子的體重和體溫都沒有發生變化，鼻拭子和咽拭子在感染後的1到7天均可以檢測到病毒。但結膜途徑感染的猴子在結膜拭子中僅在感染後第1天可以檢測到，這意味著

其中1只結膜感染的猴子和氣道感染的猴子在感染7天后實施安樂死並解剖，發現結膜途徑感染的猴子病毒廣泛分佈在鼻腔系統、眼部、咽部、口腔、腹股溝和直腸周圍的淋巴結、肺、胃、盲腸、小腸以及十二指腸等各個組織中。相比之下，氣道途徑感染的猴子病毒主要集中在肺部，病毒載量最高。此外鼻黏膜、氣管、下頜淋巴結、扁桃體、肺淋巴結和一些消化器官如結腸、盲腸等也均有分佈。值得注意的是，病毒在消化道的不同部分均可以被檢測出來，意味著消化系統可能容易受到SARS-CoV-2的攻擊。此外在結膜途徑感染後的14天和21天，可以檢測到抗SARS-CoV-2的特異性IgG抗體。以上結果表明，猴子可以通過結膜途徑感染SARS-CoV-2。相比之下，結膜感染的猴子在鼻咽系統中病毒載量和分佈相對較高。與通過氣道接種的猴子相比，肺部感染相對溫和且不集中。這兩條途徑都可能導致消化道感染。

圖4. SARS-CoV-2氣道/結膜途徑感染的恆河猴的臨床特徵、病毒分佈和血清抗體檢測

結膜途徑感染的猴子在鼻咽系統相關組織中病毒載量高，尤其是結膜、淚腺、鼻腔和咽部，這些組織是眼部到呼吸道組織的通道，特別是淚管作為管道將淚液從眼表面運輸到下鼻道進入呼吸道組織。此前的研究也證明了雖然帶有病毒的液體可以通過結膜等被吸收，但大多數液體如淚液和分泌物被排入鼻咽或吞嚥，下鼻道也有助於吸收淚液。目前人們主要通過佩戴口罩防止SARS-CoV-2從鼻腔和口腔進入，結膜途徑往往被忽視，具有潛在的傳播風險，尤其是與患者密切接觸者如臨床醫生，除了勤洗手和穿防護服以外，更應提高對眼部的保護意識。

原文地址：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.13.990226v1

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.13.990036v1

參考文獻

1. Labs rush to study coronavirus in transgenic animals — some are in short supply. Nature News. 2020 Mar 9.

2. http://www.pumc.edu.cn/blog/中國醫學科學院醫學實驗動物研究所新冠轉基因小/

3. Bao L, et al. The Pathogenicity of SARS-CoV-2 in hACE2 Transgenic Mice. bioRxiv. Posted February 28, 2020.

4. Qin C, et al. An animal model of SARS produced by infection of Macaca mulatta with SARS coronavirus. J Pathol. 2005 Jul;206(3):251-9.

5. Yao Y, et al. An animal model of MERS produced by infection of rhesus macaques with MERS coronavirus. J Infect Dis. 2014 Jan 15;209(2):236-42.

6. Shan C, et al. Infection with Novel Coronavirus (SARS-CoV-2) Causes Pneumonia in the Rhesus Macaques. Research Square. Posted 27 Feb, 2020

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關鍵字: 動物 肺炎 感染